Деннис Тейлор – Биология. В 3-х томах. Т. 1 (страница 93)

4. Замораживание — скалывание и замораживание — травление. Фрагмент ткани быстро замораживается при очень низкой температуре и затем разламывается с помощью очень острого металлического лезвия. Ткань трескается вдоль слабо соединенных плоскостей, которыми часто являются мембраны (рис. П.2.7). Образец выдерживают на холоде в глубоком вакууме; в этих условиях лед возгоняется, оставляя сколотую поверхность.

Рис. П.2.7. А. Схематическое изображение метода замораживания — скалывания. Б. Обнажение клеточных мембран в процессе скалывания

Реплика этой поверхности создается откладывающимся на ней слоем углерода. На эту реплику из углерода напыляется тяжелый металл, а ткани под репликой разрушаются, как правило, действием сильной кислоты при нормальном атмосферном давлении. Этот метод очень удобен при изучении структуры мембраны (см. рис. 7.15 и 9.13). Его преимущество состоит в том, что живые ткани быстро умерщвляются, не подвергаясь химической обработке, которая может повлиять на их структуру. Вполне вероятно, что такие клетки сохраняют свою прижизненную форму; тем самым подтверждаются данные, полученные с помощью общепринятых гистологических методик.

П.2.5.1. Сканирующий электронный микроскоп

Сравнительно недавно был введен в употребление новый тип микроскопа — сканирующий электронный микроскоп. В нем очень точно сфокусированный пучок электронов двигается взад и вперед по поверхности образца, а отраженные от его поверхности электроны собираются и формируют изображение, наподобие того, которое возникает на экране телевизора. Преимущество этого метода заключается в том, что детали строения поверхности видны с большей глубиной резкости, что создает эффект трехмерности (см. рис. 9.8 и 14.13). Разрешающая способность ниже, чем у трансмиссионного электронного микроскопа (5-20 нм), но при этом можно работать с образцами большего размера.

П.2.5.2. Электронный микроскоп высокого напряжения

Электронные микроскопы высокого напряжения (500000-1000000 В) стали использовать в биологии совсем недавно. Большее ускорение электронов позволяет им проходить через сравнительно толстые срезы (1-5 мкм), при этом получают трехмерное изображение структур при высоком разрешении, что облегчает изучение объекта. Сейчас внедряются методы, позволяющие быстро исследовать живые образцы, что в будущем должно дать весьма важную информацию.

П.2.6. Работа в лаборатории и протоколирование эксперимента

Прежде чем начать любое экспериментальное исследование, необходимо ясно представить себе цель эксперимента. Цель может состоять в проверке гипотезы, такой, например, как "Для прорастания семян необходимо наличие воды, кислорода и оптимальной температуры", или в проведении более широкого исследования, например: "Как влияет свет на поведение мокрицы?". В обоих случаях план эксперимента необходимо составить таким образом, чтобы он был выполнимым, а полученные данные были достоверными и могли успешно использоваться для того, чтобы прийти к тем или иным выводам.

Сообщение об эксперименте или его описание должно проводиться в строгой логической последовательности.

1. Название. В названии должна быть ясно сформулирована суть исследуемой проблемы. Например: "Эксперимент по изучению влияния рН на активность фермента". В названии необходимо развернуто сформулировать замысел, который конкретизируется при изложении гипотезы или цели.

2. Гипотеза или цель. Это изложение проблемы или постановка вопроса. Оно может включать перечисление исследуемых переменных и предсказание возможных результатов исследования. Например: "Изучить влияние растворов с рН от 2 до 10 на скорость переваривания белка альбумина ферментом пепсином и определить оптимум рН для этой реакции".

3. Методика или процедура. Это перечень действий, производимых во время выполнения эксперимента. Он должен быть кратким, точным и приводиться в том же порядке, в котором установлены приборы и производятся действия во время эксперимента. Метод нужно описывать в прошедшем времени и не от первого лица. Пользуясь этим описанием, другие исследователи должны быть в состоянии повторить эксперимент.

4. Результаты и наблюдения. Они могут быть качественными или количественными и должны быть представлены как можно яснее в соответствующей форме или формах. Например, в виде словесного описания, таблиц с данными, графиков, гистограмм, карт, диаграмм распределения и т. д. Если при повторных измерениях одной переменной получено несколько числовых значений, то необходимо подсчитать и записать среднее значение этой переменной.

5. Обсуждение. Оно должно быть кратким и проводиться в форме ответов на возможные сформулированные в гипотезе вопросы или же в форме подтверждения цели. Обсуждение не должно быть словесным повторением результатов. В нем нужно попытаться связать теоретические знания об исследуемых переменных с полученными результатами.

Заключение можно делать в том случае, если было получено убедительное подтверждение исходной идеи. Например, в качестве заключения на приведенную в п. 2 тему исследования можно привести следующее утверждение: "Между величиной рН и активностью фермента существует определенная зависимость, оптимальное значение рН равно х". Обсуждение результатов этого же эксперимента должно включать такие теоретические вопросы, как природа реакции и возможные химические и физические аспекты влияния рН на трехмерную структуру молекул фермента.

П.2.7. Представление данных

После проведения качественных и количественных исследований получают определенные результаты в виде описательных и численных данных. Чтобы получить максимальное количество информации, необходимо тщательно спланировать исследование, а полученные данные всесторонне обработать и внимательно проанализировать.

П.2.7.1. Составление таблиц

Таблицы относятся к наиболее простому способу представления данных. Они состоят из колонок со значениями двух или более связанных переменных. С помощью этого метода трудно получить прямое и ясное указание на связь между переменными, но он часто является первым этапом регистрации информации и служит основой для выбора последующей формы графического представления данных.

П.2.7.2. Графическое представление данных

График — это двумерное изображение зависимости между двумя или более переменными. График самой простой формы строится на двух осях. По вертикальной оси (оси у) откладываются значения, называемые ординатами, которые показывают величину зависимой переменной, т. е. функции. Это — "неизвестное количество", иными словами переменная, значения которой не выбираются экспериментатором. Горизонтальная ось х несет значения, называемые абсциссами, которые показывают величину независимой переменной. Это — "известное количество", т. е. переменная, значения которой выбираются экспериментатором.

График строится следующим образом:

1. Масштаб и интервалы на каждой оси должны выбираться в соответствии с величинами переменных, значения которых откладываются на графике таким образом, чтобы максимально использовать место на бумаге.

2. Каждая ось должна начинаться с 0, но если все значения одной переменной расположены близко друг к другу, например между 6,12 и 6,68 лежит десять точек, то, чтобы разместить эти точки, потребуется крупный масштаб. В этом случае ось также начинают с 0, но сразу после нуля на оси делается отметка о разрыве в виде знака -//-.

3. На каждой оси необходимо отметить название и размерность переменной, например "Температура,°С". Ось должна быть разделена на равные интервалы, например от 0 до 60 на 12 интервалов по 5 единиц в каждом.

4. Точки, отмеченные на графике, называются координатами. Они представляют соответствующие значения двух переменных, например когда х=а, а у=b.

5. Точки, нанесенные на основе фактических данных, необходимо отмечать кружком, крестиком или точкой в кружке, а не просто точкой.

6. Отмеченными на графике точками регистрируются фактические наблюдения. Точки могут соединяться серией прямых отрезков, начерченных по линейке, плавной кривой или в некоторых случаях кривой регрессии (линия наибольшего соответствия) (разд. П.2.8.3). Такие графики называются линейными. Точки лучше соединять прямыми отрезками или плавной кривой, а не кривой регрессии.

7. Графику необходимо дать развернутое название, например: "График, показывающий связь между...".

8. Фактические данные представлены только точками, нанесенными на график, оценки же других значений можно получить, измерив координаты любой точки, лежащей на линии. Этот метод называется интерполяцией. Сходным образом, продолжив линию, можно определить координаты крайних точек графика. Этот метод известен как экстраполяция. В обоих случаях необходимо подчеркнуть, что полученные значения являются приблизительными.

По графикам, на оси х которых откладывается время, можно подсчитать крутизну кривой или градиент любой точки. Эта величина соответствует скорости изменения исследуемой переменной. Например, на графике, показанном на рис. П.2.8, скорость роста подсчитывают путем проведения касательной к кривой в требуемой точке и построения треугольника, в котором эта касательная является гипотенузой (рис. П.2.9). Затем значение отрезка у делят на значение отрезка х и получают скорость изменения в единицах, отложенных по осям графика.