Деннис Тейлор – Биология. В 3-х томах. Т. 1 (страница 92)

Срез с ткани, залитой в ту или иную среду, можно сделать на микротоме. Для светового микроскопа срезы толщиной в несколько микрометров можно сделать с залитой в парафин ткани с помощью специального стального ножа. На ультратоме изготавливают чрезвычайно тонкие срезы (20-100 нм) для электронного микроскопа. Для этого необходим алмазный или стеклянный нож.

Срезы для светового микроскопа можно приготовить, не заливая материал в среду; для этого используют замораживающий микротом. В процессе приготовления замороженного среза образец сохраняется в замороженном и, следовательно, в твердом состоянии.

6. Окрашивание. Как правило, биологические структуры на препаратах прозрачны, поэтому для получения контраста между ними приходится прибегать к различным средствам. Самым распространенным является окрашивание. Некоторые красители, используемые в световой микроскопии, перечислены в табл. П.2.2.

Таблица П.2.2. Красители, применяемые для окраски растительных и животных тканей

Определенные красители при использовании их в низких концентрациях не токсичны для живых тканей и поэтому могут применяться для окрашивания живых организмов. Они называются прижизненными (витальными) красителями. К ним относятся такие, как метиленовый синий и нейтральный красный.

При окрашивании парафиновых срезов парафин удаляют с помощью растворителя, а срез частично обводняют перед окрашиванием.

7. Заключение. Полностью окрашенные срезы заключают на предметном стекле в специальную среду, например в канадский бальзам или эупарол, которая не пропускает воздух и способна неограниченно долго сохранять срез. Заключенный в среду срез покрывают покровным стеклом. Последовательность описанных выше действий является типичной при приготовлении тонких срезов для постоянных препаратов. Однако часто в порядок действий вносят два следующих изменения:

а) если срез сырого материала готовится вручную, то сначала делают срез, а потом фиксируют его;

б) окрашивать можно после фиксации или же в процессе обезвоживания на какой-либо ее стадии.

Например, красителем, растворенным в 50% этаноле, можно окрасить срез после его дегидратации в 50% этаноле.

Описанная процедура приготовления препаратов в основном сходна как для светового, так и для электронного микроскопов, хотя существуют некоторые различия в деталях (они отмечены в табл. П.2.3).

Таблица П.2.3. Различия в подготовке материалов для светового и электронного микроскопов

П.2.4.3. Временные препараты

Временные препараты для светового микроскопа в отличие от постоянных можно сделать сравнительно быстро. Они готовятся для проведения быстрых предварительных исследований. Для этого материал фиксируют, окрашивают и заключают в среду. Срезы можно приготовить до фиксации или мацерации (древесину, например, мацерируют). Срез свежего материала можно сделать вручную с помощью бритвы непосредственно в 70% спирте, который служит фиксатором. Для окрашивания и заключения можно использовать ряд временных красителей; некоторые из них, пригодные для окрашивания растительного материала, приведены в табл. П.2.2. Каждый срез следует помещать на чистое предметное стекло (предварительно протертое спиртом) и капнуть несколько капель красителя. При окрашивании флороглюцинолом добавляется также одна капля концентрированной соляной кислоты. Затем препарат покрывают тонким покровным стеклом, чтобы предотвратить попадание воздуха и пыли и предохранить от загрязнения объектив большого увеличения (рис. П.2.4). Если образец начнет подсыхать или если заранее известно, что потребуется длительное изучение (более 10 мин), то после окрашивания препарат следует заключить в глицерин.

Рис. П.2.4. Заключение образца и наложение покровного стекла на предметное

П.2.5. Электронный микроскоп

Разрешающая способность светового микроскопа ограничена длиной световых волн. Максимально возможное разрешение равно половине длины волны используемого света. Получить изображение объекта размером меньше, чем эта величина, невозможно. Средняя длина волны видимого света составляет примерно 550 нм, поэтому в конце XIX в. могли получить разрешение примерно в 200 нм. Незначительное увеличение разрешающей способности было достигнуто благодаря использованию специально сконструированного микроскопа с ультрафиолетовым светом (длина волны которого составляет 250 нм), обеспечивающим разрешение примерно в 100 нм. Однако многие клеточные структуры имеют меньший размер. Эта проблема была решена в тридцатые — сороковые годы, когда создание электронного микроскопа произвело революцию в биологической науке. Вместо светового излучения в электронном микроскопе используют пучок электронов, у которых длина волны значительно меньше и, следовательно, с намного большей разрешающей способностью. Длина волны электронов зависит от напряжения, подаваемого для генерации электронного пучка, но практически можно получить разрешение приблизительно в 0,5 нм, т. е. примерно в 500 раз больше, чем в световом микроскопе. Создаваемое увеличение достаточно, чтобы различить крупные молекулы. Лимитирующим фактором в достижении большего увеличения стало (и остается до сих пор) не усиление разрешающей способности микроскопа, а методы подготовки материала для исследования.

В сущности принцип действия электронного микроскопа такой же, как и светового микроскопа, в котором пучок световых лучей направляется линзой конденсора через образец, а полученное изображение затем, увеличивается с помощью линз. В табл. П.2.4 суммированы некоторые сходства и различия между этими микроскопами. Запомните также, что принципы подготовки материала для электронной и световой микроскопии примерно одинаковы, хотя имеются и важные различия (табл. П.2.3).

Таблица П.2.4. Сравнение светового и электронного микроскопов

Оператор сидит у пульта управления лицом к колонне, по которой проходит пучок электронов (рис. П.2.5). Электронный микроскоп перевернут "вверх дном" по сравнению со световым микроскопом. Здесь источник электронов находится в верхней части колонны, а сам образец — внизу (рис. П.2.6). На вольфрамовую нить накала, находящуюся в верхней части колонны, подается высокое напряжение (например 50000 В), и нить накала излучает поток электронов. Чтобы сфокусировать эти электроны (изменить их траекторию), необходимы уже не стеклянные линзы, а электромагниты. Внутри колонны создается глубокий вакуум, чтобы сократить до минимума рассеивание электронов из-за столкновения с частицами воздуха и происходящее в результате этого нагревание. В трансмиссионном (просвечивающем) электронном микроскопе электроны проходят через образец, поэтому для изучения можно использовать только очень тонкие срезы или частицы, так как электроны легко рассеиваются или поглощаются исследуемым объектом. Части образца с относительно высокой молекулярной массой в наибольшей степени вызывают рассеивание электронов, поэтому при окрашивании образца с целью увеличения контраста используются тяжелые металлы, такие, как свинец или уран. Образец обычно удерживается на маленькой медной сетке (примерно 2 мм в диаметре), которую иногда для большей прочности покрывают тонкой пластмассовой пленкой. Пройдя через образец, электроны собираются и фокусируются добавочными электромагнитными линзами. Электроны невидимы для человеческого глаза, поэтому они направляются или на флуоресцентный экран, который воспроизводит видимое изображение, или же непосредственно на фотопленку, чтобы получить постоянный фотоснимок (электронную микрофотографию).

Рис. П.2.5. Современный трансмиссионный электронный микроскоп

Рис. П.2.6. Траектория пучка электронов в трансмиссионном электронном микроскопе

Для подготовки материала к исследованию используют различные приемы (они описаны ниже), но в любом случае материал должен быть мертвым, так как в процессе наблюдения он находится в вакууме, быстро нагревается и начинает разрушаться под действием пучка электронов. Фотографировать необходимо для регистрации информации в том случае, если требуется длительное изучение образца.

1. Окрашивание ультратонких срезов тяжелыми металлами. Срезы готовятся на ультратоме и окрашиваются соединениями тяжелых металлов, такими, как нитрат свинца, уранилацетат или осмиевая кислота. Окрашенные участки становятся малопроницаемыми для электронов, и, таким образом, на микрофотографиях они выглядят темными.

2. Негативное контрастирование. При негативном контрастировании окрашивается фон, тогда как сам образец остается неокрашенным. Этот метод особенно удобен при изучении деталей строения поверхности мелких частиц, таких, как рибосомы, вирусы и фрагменты изолированных органелл и мембран, так как краситель проникает между деталями поверхностного строения.

3. Напыление. Образец бомбардируется атомами тяжелых металлов, например золотом или платиной, в определенном направлении или под определенным углом. Поверхность образца покрывается слоем металла, непроницаемого для электронов. Закрытые площади, в том числе "тень" за образцом, не покрываются металлом и остаются относительно прозрачными для электронов. Они дают белый цвет (пропускают электроны, которые равнозначны свету). Так как человеческий глаз лучше воспринимает и интерпретирует темные отпечатки, обычно печатают негативы фотографий. Напыление используют также, чтобы выявить структуру поверхности мелких частиц, например вирусов.