Деннис Тейлор – Биология. В 3-х томах. Т. 1 (страница 52)
Рис. 6.12. Ход ферментативной реакции при разных температурах
6.4.4. рН
При постоянной температуре любой фермент работает наиболее эффективно в узких пределах рН. Оптимальным считается то значение рН, при котором реакция протекает с максимальной скоростью (рис. 6.13 и табл. 6.1). При более высоких и более низких рН активность фермента снижается. Сдвиг рН меняет заряд ионизированных кислотных и основных групп, от которого зависит специфичная форма молекул фермента (разд. 5.5.4). В результате изменяется форма молекул фермента, и в первую очередь форма его активного центра. При слишком резких сдвигах рН фермент денатурирует. Свойственный данному ферменту оптимум рН не всегда совпадает с рН его непосредственного внутриклеточного окружения. Это позволяет предположить, что среда, в которой находится фермент, в какой-то мере регулирует его активность.
Рис. 6.13. Зависимость активности фермента от рН
Таблица 6.1. Оптимумы рН для некоторых ферментов
Опыт 6.3. Изучение влияния различных значений рН на активность фермента
Реактив Бенедикта
Буферные растворы с рН 3, 5, 7, 9 и 11
1%-ный раствор крахмала
Водяная баня с температурой 38°С
Бунзеновская горелка
Асбест
Держатель для пробирок, штатив с пробирками
Градуированные пипетки на 5 мл
Термометр
Таймер
Дистиллированная вода
Исходный раствор слюны
Амилаза (такая же, как та, которая содержится в слюне)
1. Сполосните рот 5 мл дистиллированной воды и выплюньте эту воду.
2. Наберите в рот 10 мл дистиллированной воды, пополощите в течение 1 мин и эту жидкость соберите.
3. Доведите объем этого раствора амилазы слюны до 40 мл дистиллированной водой.
4. Проверьте растворы амилазы, крахмала и буферные растворы на присутствие в них редуцирующих Сахаров с помощью реактива Бенедикта.
5. Пометьте этикеткой "рН 3" одну из пробирок и внесите в нее 2 мл раствора крахмала.
6. Добавьте в ту же пробирку 2 мл буферного раствора с рН 3 и тщательно перемешайте оба раствора.
7. Прокипятите не менее 4 мл раствора фермента и влейте 4 мл этого раствора в пробирку с соответствующей этикеткой.
8. В другую пробирку, также снабженную этикеткой, влейте 4 мл раствора фермента, не подвергавшегося кипячению; поставьте все три пробирки на водяную баню и выждите некоторое время (около 1 мин) для того, чтобы они успели нагреться до 38°С.
9. Влейте небольшое количество реактива Бенедикта в каждую из 11 пробирок и пометьте их цифрами 1-11.
Три следующие операции (10-12) провести очень быстро:
10. Когда растворы на водяной бане примут ее температуру, влейте забуференный раствор крахмала в некипяченый раствор фермента.
11. Хорошо перемешайте оба раствора, переворачивая пробирку, а затем снова поставьте пробирку на водяную баню.
12. Включите отсчет времени и сразу же перенесите небольшое количество реакционной смеси (примерно равное по объему взятому реактиву Бенедикта) в пробирку 1.
13. На протяжении всего опыта энергично встряхивайте смесь.
14. По истечение 1 мин перенесите в пробирку 2 вторую порцию реакционной смеси (приблизительно того же объема, что и первая).
15. Повторяйте ту же процедуру с интервалами 1 мин в течение еще 9 мин (т. е. заполните отобранными пробами пробирки 3-11).
16. Отметьте для пробирок 1-11 продолжительность инкубации, требуемой для появления первых признаков положительной реакции Бенедикта (выпадения кирпично-красного осадка).
17. Повторите тот же опыт с прокипяченным раствором фермента, начиная от п. 7.
18. Повторите весь опыт целиком с каждым из остальных буферных растворов.
19. Постройте график зависимости времени гидролиза от рН и объясните полученные результаты.
Рис. 6.14. Влияние рН на активность трех ферментов — А, В, и С
6.5. Ингибирование ферментов
Известны различные низкомолекулярные соединения, которые могут тормозить ферментативные реакции. Такие соединения называются ингибиторами ферментов. Ингибирование бывает обратимым и необратимым.
6.5.1. Обратимое ингибирование
При определенных условиях ингибитор может быть легко отделен от фермента.
Конкурентное обратимое ингибирование
В этом случае вещество, по своей структуре близкое к обычному субстрату фермента, соединяется с активным центром фермента, но не может прореагировать с ним. Находясь здесь, оно преграждает доступ к активному центру любой молекуле настоящего субстрата. Поскольку в этом случае ингибитор и субстрат конкурируют за место на активном центре фермента, эту форму ингибирования называют конкурентным ингибированием. Оно обратимо, так как при увеличении концентрации субстрата скорость реакции возрастает.
Рис. 6.15 иллюстрирует один из примеров конкурентного ингибирования.
Рис. 6.15. Пример конкурентного ингибирования. А. Фермент сукцинатдегидрогеназа катализирует превращение янтарной кислоты в фумаровую. Б. Конкурентное ингибирование фермента малоновой кислотой
Явление конкурентного ингибирования используется в химиотерапии. Цель химиотерапии — уничтожить при помощи тех или иных химических препаратов возбудителя болезни, не повреждая при этом ткани организма-хозяина. Во время второй мировой войны для борьбы с инфекционными заболеваниями широко применялись сульфаниламидные препараты, или сульфаниламиды, — производные сульфаниловой кислоты. Сульфаниламиды по своей химической структуре близки к парааминобензойной кислоте (ПАБК) — необходимому фактору роста многих патогенных бактерий. ПАБК требуется бактериям для синтеза фолиевой кислоты, которая служит у них кофактором фермента. Действие сульфаниламидов связано с нарушением синтеза фолиевой кислоты из ПАБК.
Животные клетки не чувствительны к сульфаниламидам, хотя им для некоторых реакций и требуется фолиевая кислота. Объясняется это тем, что они используют преобразованную фолиевую кислоту; метаболический путь, который обеспечивал бы ее синтез, у животных отсутствует.
Неконкурентное обратимое ингибирование