Деннис Тейлор – Биология. В 3-х томах. Т. 1 (страница 51)

Рис. 6.9. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента

Опыт 6.1. Изучение влияния концентрации фермента на гидролиз сахарозы, катализируемый сахаразой (инвертазой)

2%-ный раствор сахарозы

1, 0,75 и 0,5%-ный растворы сахаразы (инвертазы)

Реактив Бенедикта

12 пробирок со штативом

Водяные бани с температурой 38 и 100°С

Стеклянные палочки

Таймер

Дистиллированная вода

Этикетки

Бунзеновская горелка

1. Добавьте 2 мл прозрачного синего реактива Бенедикта к 2 мл прозрачного бесцветного 1%-ного раствора сахаразы. Нагрейте смесь на водяной бане при 100°С в течение 5 мин (реакция Бенедикта).

2. Повторите процедуру 1 с 2 мл прозрачного бесцветного 2%-ного раствора сахарозы, а затем с 2 мл дистиллированной воды.

3. 5 мл 1%-ного раствора сахаразы доведите до кипения.

4. В восемь чистых сухих пробирок с этикетками 1-8 влейте по 1 мл реактива Бенедикта.

5. Влейте 5 мл 2%-ного раствора сахарозы в пробирку с этикеткой S и поместите на водяную баню, в которой на протяжении всего эксперимента поддерживается температура 38°С.

6. Влейте 5 мл 1%-ного раствора сахаразы в пробирку с этикеткой Е и поместите на водяную баню с температурой 38°С.

7. Выдержите обе пробирки вместе с их содержимым на водяной бане в течение 5 мин для того, чтобы они приобрели нужную температуру.

8. Добавьте раствор фермента к раствору сахарозы и переверните пробирку, чтобы хорошо перемешать эти два раствора.

9. Сразу же включите отсчет времени и вновь поставьте пробирку, содержащую реакционную смесь, на водяную баню.

10. В течение всего опыта непрерывно перемешивайте реакционную смесь.

11. После 30 с инкубации перенесите 1 мл смеси в пробирку 1.

12. С интервалами в 30 с отберите такие же пробы и перенесите их по очереди в пробирки 2-8.

13. Нагрейте пробирки 1-8 на водяной бане с температурой 100°С в течение 5 мин. Отметьте время первого появления кирпично-красного осадка, свидетельствующего о положительной реакции на редуцирующий сахар.

14. Повторите тот же эксперимент, использовав на этот раз прокипяченный раствор фермента (см. п. 3).

15. Повторите всю последовательность процедур дважды: с 0,75%-ным и 0,5%-ным растворами сахаразы.

16. Зафиксируйте наблюдения и объясните полученные результаты.

6.4.2. Концентрация субстрата

При данной концентрации фермента скорость ферментативной реакции возрастает с увеличением концентрации субстрата (рис. 6.10). Теоретическая максимальная скорость реакции V_max никогда не достигается, но наступает момент, когда дальнейшее увеличение концентрации субстрата уже не влечет за собой сколько-нибудь заметного изменения скорости реакции. Это следует объяснить тем, что при высоких концентрациях субстрата активные центры молекул фермента в любой данный момент оказываются практически насыщенными. Таким образом, сколько бы ни было в наличии избыточного субстрата, он может соединиться с ферментом лишь после того, как образовавшийся ранее фермент-субстратный комплекс диссоциирует на продукт и свободный фермент. Поэтому при высоких концентрациях субстрата скорость ферментативной реакции лимитируется и концентрацией субстрата, и временем, которое требуется для диссоциации фермент-субстратного комплекса.

Рис. 6.10. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата

6.4.3. Температура

Влияние температуры на скорость ферментативной реакции может быть выражено через температурный коэффициент Q₁₀:

В пределах 0-40°С Q₁₀ ферментативной реакции равен 2. Иными словами, при каждом повышении температуры на 10°С скорость ферментативной реакции удваивается. С повышением температуры движение молекул ускоряется, и у молекул реагирующих веществ оказывается больше шансов столкнуться друг с другом. Увеличивается, следовательно, и вероятность того, что реакция между ними произойдет. Температура, обеспечивающая наибольшую активность, называется оптимальной температурой. За пределами этого уровня скорость ферментативной реакции снижается, несмотря на увеличение частоты столкновений. Происходит это вследствие разрушения вторичной и третичной структур фермента, иными словами, вследствие того, что фермент претерпевает денатурацию (рис. 6.11).

Рис. 6.11. Влияние температуры на активность такого фермента, как амилаза слюны

6.1. Объясните, каким образом денатурация фермента может повлиять на его каталитическую активность.

Когда температура приближается к точке замерзания или оказывается ниже ее, ферменты инактивируются, но денатурации при этом не происходит. С повышением температуры их каталитическая активность вновь восстанавливается.

В наше время для длительного хранения пищевых продуктов широко используют такой способ, как быстрое их замораживание. Оно предотвращает рост и размножение микроорганизмов, а также инактивирует их пищеварительные ферменты, так что они оказываются уже не в состоянии вызвать разложение пищевых продуктов. Инактивируются также и ферменты, находящиеся в самих пищевых продуктах. Замороженные продукты не должны размораживаться до того момента, как они понадобятся.

Опыт 6.2. Изучение распределения каталазы в намоченных семенах гороха и влияния температуры на активность этого фермента

Каталаза — это фермент, катализирующий разложение пероксида водорода с образованием молекулярного кислорода, выделяющегося в виде пузырьков газа:

Пероксид водорода образуется в некоторых растительных и животных клетках в качестве побочного продукта метаболизма. Соединение это токсично для клеток, и каталаза обеспечивает эффективное его удаление. Каталаза — один из наиболее быстро работающих ферментов: при 0°С одна молекула каталазы разлагает в 1 с до 40000 молекул пероксида водорода. Локализуется каталаза в микротельцах (гл. 7) и пероксисомах (гл. 7 и 9).

Горсть намоченного гороха

Раствор пероксида водорода

Пробирки со штативом

Водяные бани с температурой 40, 60, 70, 80 и 100°С

Часы

Термометр

Скальпели, ножницы и пинцеты

Держатель для пробирок

Стеклянная палочка

Белая кафельная плитка

1. Убедитесь в наличии каталазы. Для этого разомните одну горошину и нанесите на нее несколько капель пероксида водорода.

2. Снимите с гороха кожуру и проверьте на каталазу по отдельности кожуру и семядоли.

3. Поставьте две пробирки с дистиллированной водой на водяную баню с температурой 40°С.

4. Прокипятите в отдельной пробирке три целые горошины, а затем поместите их в одну из пробирок на водяной бане.

5. В другую пробирку на водяной бане положите три горошины, не подвергавшиеся кипячению.

6. Выдержите пробирки на водяной бане в течение времени, достаточного для того, чтобы они приняли ее температуру (около 10 мин).

7. Проверьте каждую из горошин на каталазную активность.

8. Повторите тот же эксперимент при 50, 60, 70, 80 и 100°С.

9. Зафиксируйте наблюдения и объясните полученные результаты.