Уолтер Айзексон – Взломавшая код. Дженнифер Даудна, редактирование генома и будущее человечества (страница 35)

Чжан не скрывал одной вещи, которую узнал из работы Даудны и Шарпантье: только прочитав статью, он узнал, что существует способ объединить cгРНК и tracгРНК и создать одиночную направляющую РНК, которую можно запрограммировать на распознавание нужной ДНК-последовательности. “Мы адаптировали гибрид cгРНК и tracгРНК, недавно испытанный in vitro”, – написал он позже, сославшись на статью Даудны и Шарпантье. Марраффини, который по-прежнему работал с Чжаном в июне 2012 года, подтверждает его слова: “Мы с Фэном начали использовать одиночную направляющую РНК только после того, как прочитали статью Дженнифер”.

Как отмечает Чжан, создание одиночной направляющей РНК было полезным, однако не принципиально важным изобретением. Система CRISPR-Cas9 может работать, если оставить tracгРНК и cгРНК отдельными элементами, а не объединить их в одну, более простую молекулу, как сделала команда Даудны и Шарпантье. Одиночная направляющая РНК упрощает систему и облегчает ее внедрение в клетки человека, но работу системы обеспечивает не она[187].

Глава 25. Даудна вступает в гонку

Удивительно, что Дженнифер Даудна вообще участвовала в конкурентной борьбе за право раньше остальных обеспечить работу CRISPR-Cas9 в организме человека. Она никогда не экспериментировала с клетками человека и никогда не конструировала инструменты для редактирования генома, такие как TALEN. Опыта в этой сфере не было и у ее ведущего исследователя Мартина Йинека. “В моей лаборатории работало много биохимиков, специалистов по кристаллографии и подобным вещам, – говорит она. – Но экспертов по созданию культивированных человеческих клеток и даже клеток круглого червя у нас не было”. В связи с этим тот факт, что Даудна вступила в борьбу, хоть и знала, что многие будут пытаться создать на основе их открытий о CRISPR-Cas9 инструмент, работающий в клетках человека, свидетельствует о ее готовности идти на риск.

Даудна правильно поняла, что использование CRISPR для редактирования генома человека станет следующим прорывом. Она решила, что другие исследователи, включая Эрика Сонтхаймера и, вероятно, сотрудников Института Брода, стремятся как можно быстрее достичь цели, и захотела вступить с ними в конкуренцию. “После нашей июньской статьи я поняла, что нужно ускориться, но наши соавторы, казалось, об этом и не думали, – вспоминает она. – Это меня удручало. Я стремлюсь везде быть первой”. Она подталкивала Йинека работать активнее. “Ты должен сделать это своей задачей номер один, – твердила она, – потому что если Cas9 станет надежной технологией для редактирования генома человека, то мир изменится”. Йинек боялся, что выполнить задачу будет нелегко. “У нас не было специалистов по редактированию генома в отличие от некоторых лабораторий, где работали пионеры этого метода, – говорит он, – и потому нам приходилось заново изобретать то, что другие уже сделали”[188].

Позже Даудна признала, что сначала пережила “множество провалов”, пытаясь наладить работу CRISPR-Cas9 в клетках человека[189]. Но когда начался осенний семестр 2012 года, а Чжан ускорил работу, чтобы быстрее закончить собственные эксперименты, ей улыбнулась удача. В лабораторию пришла новая студентка Александра Ист, которая имела опыт работы с клетками человека. Особенно любопытной была ее подготовка: она училась редактировать геном, когда была лаборанткой в Институте Брода, где работала с Фэном Чжаном и другими исследователями.

Ист сумела вырастить необходимые человеческие клетки и начала эксперименты по внедрению Cas9 в их ядра. Получив первые результаты, она не смогла однозначно сказать, свидетельствуют ли данные о том, что происходит редактирование генома. Порой результаты биологических экспериментов оказываются неочевидными. Но Даудна, у которой глаз был наметан, сочла эксперименты успешными. “Когда [Александра] показала мне данные, мне сразу стало ясно, что ей удалось получить прекрасные свидетельства редактирования генома в клетках человека с помощью Cas9, – говорит Даудна. – Этим студент, не завершивший обучение, отличается от человека вроде меня, который уже некоторое время работает в своей сфере. Я знала, что именно хочу увидеть, и стоило мне взглянуть на полученные ею данные, как что-то щелкнуло и я подумала: «Да, у нее получилось». Она сомневалась в этом и подозревала, что ей придется провести эксперименты снова, но я сказала: «О боже, это же здорово! Это просто замечательно!»”[190]

По мнению Даудны, данные свидетельствовали, что обеспечение работы CRISPR-Cas9 в клетках человека нельзя считать ни серьезным прорывом, ни новым изобретением: “Было хорошо известно, что можно пометить белки сигналами ядерной локализации, чтобы направить их в ядро, и именно так мы поступили с Cas9. Кроме того, было известно, как изменить кодоны в гене, чтобы белок лучше экспрессировался в клетках млекопитающих, и это мы тоже сделали”. Ей казалось, что в этом не было ничего особенно нового, хотя она и спешила первой достичь поставленной цели. Чтобы поместить ферменты в ядро клетки, достаточно было адаптировать методы, которые использовались ранее, например TALEN. Ист добилась этого за несколько месяцев. “Когда стало понятно, из каких компонентов состоит система, сложностей уже не возникло, – говорит Даудна. – С задачей справилась студентка первого года магистратуры”.

Даудна считала, что нужно как можно быстрее что-нибудь опубликовать. Она поняла – и поняла совершенно верно, – что, если другие лаборатории первыми покажут, что CRISPR-Cas9 можно поместить в клетки человека, это назовут важным открытием. Она настояла, чтобы Ист подкрепила свои данные повторными экспериментами. Йинек между тем искал способ превратить созданную ими в пробирке одиночную направляющую РНК в направляющую, которая сможет доставлять Cas9 к мишени в клетке человека. Было непросто. Оказалось, что полученная им одиночная направляющая РНК слишком коротка, чтобы максимально эффективно работать с человеческой ДНК.

Глава 26. Фотофиниш

Когда Фэн Чжан начал проверять возможность применения одиночной направляющей РНК, он обнаружил, что вариант, описанный в статье Даудны и Шарпантье, опубликованной в июне 2012 года, плохо работает в клетках человека. Он создал более длинную вариацию одиночной направляющей РНК со шпилькой, и такая вариация оказалась более практичной[191].

Модификация Чжана показала, в чем разница между работой в пробирке, по примеру команды Даудны, и работой в клетках человека. “Вероятно, биохимические данные убедили Дженнифер, что РНК не нужен этот дополнительный фрагмент, – говорит он. – Она полагала, что короткой одиночной направляющей РНК, созданной Йинеком, достаточно, поскольку в пробирке все работало. Я же знал, что биохимия не всегда может спрогнозировать, что на самом деле будет происходить в живых клетках”.

Чжан внедрил в систему CRISPR-Cas9 и другие изменения и оптимизировал ее для работы в клетках человека. Порой бывает сложно провести крупную молекулу сквозь мембрану, окружающую ядро. Техника Чжана включала маркировку фермента Cas9 последовательностью ядерной локализации, которая дает белку доступ к ядру клетки, куда иначе невозможно проникнуть.

Кроме того, Чжан применил известную технику “оптимизации использования кодонов”, чтобы обеспечить работу системы CRISPR-Cas9 в клетках человека. Кодоны – это трехбуквенные фрагменты ДНК, передающие инструкции о последовательности аминокислот, из которых состоят белки. Одну аминокислоту могут кодировать разные кодоны, причем в разных организмах с задачей наиболее эффективно справляются разные вариации кодонов. При попытке перенести систему экспрессии генов из одного организма в другой, например от бактерии к человеку, оптимизация использования кодонов позволяет заменить последовательность кодонов на наиболее подходящую.

Пятого октября 2012 года Чжан отправил свою статью редакторам Science, которые приняли работу к публикации 12 декабря. В списке авторов значились имена Шуайляна Линя, того самого постдока, который заявил, что у Чжана почти не наблюдалось прогресса, пока не вышла статья Даудны и Шарпантье, и Лучано Марраффини, посоветовавшего Чжану сосредоточиться на Cas9, но оставшегося за бортом при подаче заявки на патент. В статье описывались проведенные эксперименты и полученные результаты, а завершалась она весьма эффектным и значимым предложением: “Способность осуществлять мультиплексное редактирование генома в клетках млекопитающих может найти широкое применение в фундаментальной науке, биотехнологической отрасли и медицине”[192].

Двадцать пять лет Джордж Черч занимался различными методами редактирования генома. Он учил Фэна Чжана и формально оставался научным руководителем его ведущего соавтора, Лэ Цуна. Однако до поздней осени 2012 года никто из них не сказал ему – во всяком случае, как считал он сам, – что более года они работают над превращением CRISPR в инструмент для редактирования генома человека.

Лишь в ноябре, когда Черч приехал в Институт Брода, чтобы выступить там с лекцией, он узнал, что Чжан отправил в Science статью о применении системы CRISPR-Cas9 в клетках человека. Черч был потрясен, ведь он и сам только что отправил в тот же журнал статью на ту же тему. Он рассердился и почувствовал, что его предали. В прошлом он публиковал статьи о редактировании генома вместе с Чжаном и не понимал, что бывший студент теперь считает его конкурентом, а не соратником. “Думаю, Фэн не проникся в полной мере культурой моей лаборатории, – отмечает Черч. – А может, он просто решил, что ставки слишком высоки, и потому ни о чем мне не сказал”. Хотя Лэ Цун перешел в Институт Брода, чтобы работать с Чжаном, он по-прежнему учился в Гарварде, где Черч оставался его научным руководителем. “Я расстроился, и мне показалось, что нарушены правила, ведь мой собственный студент занимался тем, что интересовало и меня, о чем он прекрасно знал, но все же решил мне об этом не сообщать”, – говорит Черч.