Евгений Князев – Начальные методы клеточной биологии (страница 3)

Помимо температуры, влажности и содержания CO₂, на успешное культивирование клеток оказывает влияние ряд других факторов, например, освещение может воздействовать на клеточный метаболизм и функционирование клеток. Некоторым клеткам для оптимального роста и размножения требуется определенный режим светового цикла или определенная интенсивность света. Большинство же клеточных линий выращивается в инкубаторах в отсутствие света. Хорошая вентиляция инкубационной камеры обеспечивает постоянное обновление воздуха и предотвращает накопление вредных газов и испарений. Концентрация кислорода в инкубационной камере также влияет на клеточный метаболизм и функции клеток. Некоторым клеткам необходима повышенная концентрация кислорода для оптимального роста и функционирования. Для других клеток или в рамках эксперимента может потребоваться создать гипоксию, т. е. сниженное количество кислорода. Существуют специальные инкубаторы, которые могут регулировать уровень кислорода, например, путем подключения к инкубатору источника азота, за счет чего происходит вытеснение излишнего кислорода для поддержания необходимого соотношения газов.

Высокий уровень шума и вибраций может оказывать негативное влияние на клеточный рост и функционирование. В связи с этим необходимо выбирать местоположение инкубатора таким образом, чтобы минимизировать воздействие внешних факторов. Кроме вышеперечисленных, существуют и другие факторы, влияющие на культивирование клеток, – гидродинамика среды, электромагнитные поля и т. д. Их важность и воздействие на клеточные процессы варьируются в зависимости от конкретных условий эксперимента.

Стерильность при работе с клеточными культурами

Стерильность играет решающую роль в культивировании клеток, поскольку любое загрязнение среды или культуральной посуды может привести к контаминации, что негативно скажется на результатах эксперимента.

Чаще всего при культивировании клеток используется культуральная посуда, простерилизованная производителем и поставляемая в герметичной упаковке для сохранения стерильности. Однако если необходимо использовать культуральную посуду повторно, то прежде всего ее нужно тщательно очистить, чтобы удалить все загрязнения и остатки предыдущих экспериментов, вымыв в теплой мыльной воде или с применением специальных моющих средств для удаления белковых отложений либо других загрязнений. После очистки культуральную посуду следует простерилизовать, чтобы предотвратить загрязнение микроорганизмами и исключить риск контаминации клеточной культуры.

До использования посуда должна храниться в стерильных условиях, т. е. в стерильных пакетах либо в специальных шкафах или инкубаторах. Важно предотвратить и дальнейшее ее загрязнение микроорганизмами из окружающей среды. Для этого при работе необходимо соблюдать правила асептики – использовать перчатки, халаты, маски и защитные очки, а также проводить все манипуляции в стерильном ламинарном шкафу и/или чистом помещении.

Существует несколько методов стерилизации, которые могут быть использованы для обеззараживания инструментов, культуральной посуды и сред.

Автоклавирование: это один из самых распространенных способов стерилизации, при котором материалы подвергаются воздействию пара высокой температуры (чаще всего в диапазоне 120–132 °C) при повышенном давлении в автоклаве.

Химическая стерилизация: использование химических веществ, таких как спирт, перекись водорода, хлоргексидин и др., для уничтожения микроорганизмов.

Фильтрация: прохождение среды или растворов через микропористый фильтр (с размером пор 0,22 мкм и менее) приводит к фильтрации бактерий и даже вирусов.

Ультрафиолетовое облучение: ультрафиолетовое излучение используется для уничтожения микроорганизмов на поверхности инструментов и культуральной посуды.

Радиационная стерилизация: облучение (чаще всего гамма- и бета-излучение) применяется для промышленной стерилизации одноразовых изделий из полимерных материалов.

Для поддержания стерильности во время культивирования клеток необходимо соблюдать следующие меры предосторожности:

• работать в чистой и стерильной среде, например, в ламинарном потоке в специальных боксах;

• использовать стерильные инструменты и культуральную посуду;

• периодически проверять эффективность стерилизации и обеззараживания оборудования, например, бактериологическими методами;

• избегать контакта нестерильных поверхностей с культуральной средой или клетками.

Для сдерживания роста небольшого количества микроорганизмов, которые могут попасть в культуральную среду при работе с клетками, используются растворы антибиотиков (антибактериальных средств) и/или антимикотиков (противогрибковых средств), однако они не смогут предотвратить рост микроорганизмов при избыточном попадании или при контаминации резистентными штаммами. Кроме того, в ряде экспериментов антибиотики и антимикотики недопустимы.

Регулярное обновление навыков и техник стерильной работы и соблюдение правил стерильности являются важнейшими аспектами успешного культивирования клеток. Это подразумевает и обучение персонала, и обновление протоколов и процедур в соответствии с последними рекомендациями и стандартами, которые содержатся в нескольких авторитетных источниках. Вот некоторые из них.

1. Американская ассоциация клеточной биологии (American Society for Cell Biology, ASCB) предоставляет рекомендации и образовательные ресурсы по различным аспектам клеточной биологии, включая культивирование клеток.

2. Европейская фармакопея (European Pharmacopoeia) публикует стандарты, которые включают методы контроля качества клеточных культур, используемых в медицинских и фармацевтических исследованиях.

3. «Американская коллекция типовых культур» (American Type Culture Collection, ATCC) устанавливает стандарты и протоколы культивирования клеток, а также тестирования на контаминацию.

4. Международная организация по стандартизации (International Organization for Standardization, ISO) публикует стандарты, касающиеся биотехнологий и лабораторной практики, в том числе ISO 9001 и ISO 13485, которые относятся к системам менеджмента качества в биотехнологической и медицинской промышленности.

5. «Стандарты надлежащей лабораторной практики» (Good Laboratory Practice, GLP) регламентируют процессы и процедуры для обеспечения надежности и воспроизводимости результатов исследований, включая культивирование клеток.

6. «Стандарты надлежащей производственной практики» (Good Manufacturing Practice, GMP) регламентируют производственные процессы в биотехнологии и фармацевтике, в том числе стерильные техники и контроль качества клеточных культур.

7. Национальные институты здравоохранения США (National Institutes of Health, NIH) предоставляют руководства и стандарты по различным аспектам биомедицинских исследований, включая культивирование клеток и предотвращение контаминации.

8. Федеральное агентство по контролю за продуктами и лекарствами США (Food and Drug Administration, FDA) публикует руководства и стандарты, касающиеся использования клеточных культур в медицинских исследованиях и производстве.

Эти рекомендации и стандарты помогают поддерживать высокий уровень стерильности и качества в процессе культивирования клеток, способствуют надежности и воспроизводимости результатов исследований.

В случае возникновения контаминации необходимо немедленно принять меры по ее устранению, такие как удаление зараженных культур и поверхностей, проведение дополнительных процедур стерилизации и анализ источников заражения для предотвращения повторного возникновения проблемы.

Далее перечислены основные признаки контаминации и методы их выявления.

1. Визуальная оценка. Одним из первых признаков контаминации является изменение прозрачности культуральной среды. Бактериальная и грибковая контаминация может вызывать помутнение. В средах часто присутствуют индикаторные красители, например феноловый красный, изменяющие свой цвет в зависимости от pH среды. Значимое закисление среды может быть обусловлено контаминацией культуры. Визуальные признаки контаминации при световой микроскопии включают появление маленьких движущихся точек (бактерии) или нитей (грибы). Особый тип контаминации связан с заражением культуры микоплазмой. Микоплазмы слишком малы, чтобы их можно было увидеть под обычным световым микроскопом, но их можно обнаружить с помощью специальной флуоресцентной окраски.

Конец ознакомительного фрагмента.

Текст предоставлен ООО «Литрес».

Прочитайте эту книгу целиком, купив полную легальную версию на Литрес.

Безопасно оплатить книгу можно банковской картой Visa, MasterCard, Maestro, со счета мобильного телефона, с платежного терминала, в салоне МТС или Связной, через PayPal, WebMoney, Яндекс.Деньги, QIWI Кошелек, бонусными картами или другим удобным Вам способом.