Евгений Князев – Начальные методы клеточной биологии (страница 2)

Российская коллекция клеточных культур включает следующие специализированные коллекции:

• Коллекция культур клеток позвоночных (Институт цитологии РАН);

• Коллекция клеточных линий человека и животных для исследований в области вирусологии (НИИ гриппа МЗ РФ);

• Коллекция перевиваемых соматических клеток позвоночных (НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского МЗ РФ);

• Коллекция перевиваемых соматических клеток позвоночных медицинского назначения (Екатеринбургский НИИ вирусных инфекций Роспотребнадзора МЗСР РФ);

• Коллекция перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (Всероссийский НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко, РАСХН);

• Всероссийская коллекция постоянных линий клеток беспозвоночных (Всероссийский НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко, РАСХН);

• Всероссийская коллекция культур клеток высших растений (Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева, РАН);

• Коллекция генетически трансформированных pRi корней высших растений (Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева, РАН).

В рамках поддержания Российской коллекции клеточных культур осуществляются паспортизация, хранение и получение новых линий. Некоторые научно-исследовательские институты и фирмы имеют индивидуальные коллекции клеточных культур; многие фирмы поставляют клеточные линии и из зарубежных коллекций.

Наиболее крупные клеточные коллекции за рубежом – это American Type Culture Collection (ATCC) в США, European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) в Европе, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen в Германии, Riken BRC Cell Engineering Division – Cell Bank в Японии.

Все клеточные линии в данных коллекциях идентифицируются, как правило, по характерному набору коротких тандемных повторов. Рекомендуемые идентификация и описание клеточных линий осуществляются в соответствии с принятыми стандартами GLP (Good Laboratory Practice – «надлежащая лабораторная практика»), требованиями ВОЗ, Минздрава Российской Федерации, FDA (Food and Drug Administration) США и других локальных органов – благодаря этому данные линии могут воспроизводимо использоваться в научных и клинических целях.

Основные принципы культивирования клеток

Культивирование клеток представляет собой фундаментальный метод современной биологии и медицины, позволяющий исследователям изучать клеточные процессы, проводить эксперименты и разрабатывать новые терапевтические подходы.

Основные компоненты культивирования клеток

1. Клеточные субстраты – поверхности, на которых клетки крепятся и растут. Это могут быть поверхности чашек Петри или иной культуральной посуды из стекла или пластика, а также специальные материалы с определенными свойствами адгезии для конкретных типов клеток. Материалы обрабатывают физически и/или химически для улучшения прикрепления клеток (например, частично окисляют плазмой или химическими окислителями), а также покрывают определенными веществами, улучшающими прикрепление и рост клеток (например, полилизином или коллагеном).

2. Питательные среды – специально разработанные смеси питательных веществ, которые обеспечивают клеткам все необходимые компоненты для роста и размножения. Питательные среды могут быть жидкими или гелеобразными и содержать различные добавки, такие как гормоны, антибиотики и факторы роста.

3. Условия инкубации – оптимальные условия для роста клеток, т. е. температура, влажность, содержание CO₂ и другие параметры окружающей среды. Обеспечение правильных условий играет важную роль в успешном культивировании клеток.

Подготовка питательной среды

Подготовка оптимальной питательной среды является одним из ключевых этапов успешного культивирования клеток, поскольку состав среды влияет на клеточный метаболизм и, соответственно, релевантность результатов эксперимента тому, что происходит in vivo. Культуральная среда представляет собой смесь питательных веществ, которые обеспечивают клеткам все необходимые компоненты для роста, размножения и поддержания их жизнеспособности.

Питательная среда для культивирования клеток обычно включает буферные системы, аминокислоты, витамины, углеводы и дополнительные компоненты, такие как гормоны и факторы роста. Выбор компонентов зависит от типа клеток, которые планируется культивировать, и условий, необходимых для их оптимального роста. Так, некоторые клеточные линии требуют дополнительного обогащения среды определенными аминокислотами или факторами роста для нормального функционирования. Часто в качестве источника гормонов и факторов роста используют эмбриональную телячью сыворотку (fetal bovine serum, или fetal calf serum).

Питательная среда может быть как изготовленной коммерчески, так и приготовленной самостоятельно в лаборатории. Для самостоятельной подготовки среды необходимо смешать все компоненты в указанных пропорциях в дистиллированной воде, при необходимости регулируя pH раствора. После приготовления среду следует стерилизовать, чтобы предотвратить загрязнение микроорганизмами.

Стерильность является критическим условием для успешного культивирования клеток. Даже небольшое загрязнение среды микроорганизмами может привести к контаминации культуры и нежелательным изменениям в клеточном росте. В связи с этим необходимо обеспечивать стерильность всех используемых материалов, а также среды, инструментов, культуральной посуды и строго следить за соблюдением правил асептики при проведении клеточных экспериментов.

Подготовка клеточного субстрата

Клеточный субстрат представляет собой поверхность, на которой клетки крепятся и растут в лабораторных условиях. Его подготовка – важный этап в культивировании клеток, поскольку он обеспечивает оптимальные условия для их адгезии и роста.

Выбор подходящего материала для клеточного субстрата зависит от типа клеток, которые планируется культивировать, и особенностей эксперимента. Популярными материалами являются пластик, стекло, полимеры и гели. Каждый материал имеет свои преимущества и недостатки, и выбор должен основываться на конкретных требованиях эксперимента.

Обработка поверхности клеточного субстрата критически значима для обеспечения оптимальных условий для адгезии клеток. Обработку можно производить различными способами, например, модифицируя поверхности субстрата различными белковыми покрытиями, такими как коллагены, фибронектин, ламинины и др., либо физически и/или химически обрабатывая поверхности для улучшения адгезии клеток (например, используя частичное окисление плазмой или химическими окислителями).

Подготовка культуральной посуды является важной стадией в процессе культивирования клеток, поскольку обеспечивает стерильные условия для их роста и размножения. Этот этап включает ряд ключевых действий, которые необходимо выполнить для предотвращения загрязнения культуры микроорганизмами и обеспечения успешного роста клеток, что будет подробнее обсуждено ниже.

Создание оптимальных условий инкубации

Оптимальные условия инкубации играют решающую роль в успешном культивировании клеток, поскольку обеспечивают необходимые параметры окружающей среды для оптимального роста и размножения клеток.

Температура имеет фундаментальное значение в регуляции биохимических процессов в клетках. Она влияет на скорость химических реакций, метаболические пути, а также на структуру и функцию белков, ферментов и мембран. В связи с этим поддержание оптимальной температуры является критическим аспектом успешного культивирования клеток. Для этого обычно используются клеточные инкубаторы. Электронные инкубаторы обеспечивают точный контроль температуры с помощью датчиков и регуляторов, что позволяет поддерживать стабильные условия в течение всего времени эксперимента. Для большинства клеток оптимальная температура составляет около 37 °C, что соответствует температуре тела человека. Однако существуют клеточные линии, которые лучше растут при более низких (например, 30–33 °C) или высоких температурах (например, 40–42 °C, а для некоторых термофильных бактерий – до 60–70 °C).

Влажность окружающей среды также важна в культивировании клеток: она влияет на множество факторов, включая испарение среды, осмотическое давление и дыхание клеток. Поддержание оптимального уровня влажности в инкубационной камере обеспечивает комфортные условия для клеточного роста и функционирования. Этот уровень зависит от типа клеток, культивируемых в эксперименте, и может варьироваться в зависимости от требований (обычно – от 60 до 80 %). Чаще всего уровень влажности поддерживается за счет испарения воды из специальных поддонов, устанавливаемых в инкубаторы. Иногда для контроля влажности в инкубационной камере используются гигрометры, измеряющие относительную влажность воздуха. Это позволяет точно контролировать и регулировать уровень влажности в течение всего времени эксперимента при особых требованиях. Высокая влажность в инкубаторе для культивирования помогает предотвратить испарение среды и обеспечить лучший обмен газами между жидкой средой и воздухом внутри инкубатора.

Концентрация углекислого газа (CO₂) в инкубационной среде играет ключевую роль в регуляции pH среды и влияет на множество клеточных процессов, включая дыхание, рост и метаболизм. Поддержание оптимального содержания CO₂ в воздухе инкубатора является важным аспектом успешного культивирования клеток. Обычно оптимальное содержание CO₂ в инкубационной камере составляет около 5–10 %, что примерно соответствует уровню углекислого газа в крови и тканевой жидкости человека. Буферные системы питательной среды подбираются таким образом, чтобы поддерживать оптимальное значение pH именно при этом уровне CO₂. Недостаточное содержание CO₂ может привести к алкалозу (защелачиванию) среды, в то время как избыточное содержание CO₂ может вызвать ацидоз (закисление). Для поддержания оптимального содержания CO₂ используют специальные инкубаторы, которые настраивают на нужный уровень CO₂. Обычно инкубаторы оснащены системами регулирования, автоматически поддерживающими заданное содержание CO₂ путем подачи газа из подключенного баллона или удаления газа из камеры. Кроме того, в среды нередко добавляется индикатор, позволяющий отслеживать значимые изменения pH среды. Например, чаще всего используемый феноловый красный придает среде красный цвет, при закислении желтеет, а при защелачивании становится фиолетовым.