Деннис Тейлор – Биология. В 3-х томах. Т. 1 (страница 74)
Арнон совершенно верно предсказал, что фотофосфорилирование, как и окислительное фосфорилирование, должно быть сопряжено с переносом электронов в мембранах. Перенос электронов — это основа для понимания как фотосинтеза, так и дыхания.
Циклическое и нециклическое фотофосфорилирование
Роль световых реакций заключается в синтезе АТФ и НАДФ·Н2 за счет энергии света. Этот процесс связан с переносом электронов от главных пигментов, а свет доставляет энергию для такого переноса:
Судьба таких электронов отражена на рис. 9.15. Путь переноса электронов, показанный на этом рисунке, иногда называют "Z-схемой", так как эта схема похожа на букву Z. Вспомните, что отдача электрона — это окисление, а присоединение электрона — восстановление (см. Приложение 1.2). Для удобства на Z-схеме показаны два электрона, хотя на самом деле они поступают в систему по одному.
Судьба электронов. Во-первых, электрон из фотосистемы I или II поднимается на более высокий энергетический уровень, т. е. приобретает избыток энергии (энергию возбуждения). Вместо того чтобы вернуться в фотосистему, возвратившись на свой исходный уровень с потерей энергии (скажем, в результате флуоресценции), такой электрон захватывается акцептором электронов (X или Y на рис. 9.15). Это очень важное превращение световой энергии в химическую энергию. Акцептор электронов таким образом восстанавливается, а в фотосистеме остается положительно заряженный (окисленный) пигмент. Далее электрон мигрирует по нисходящей линии (в отношении своей энергии) и переходит от одного акцептора электронов к другому в ряде окислительно-восстановительных реакций. Такой перенос электронов сопряжен с образованием АТФ — как при циклическом, так и при нециклическом фотофосфорилировании; к тому же при нециклическом фотофосфорилировании происходит восстановление НАДФ.
Рис. 9.15. Z-схем а переноса электронов при циклическом и нециклическом фотофосфорилировании
Нециклическое фотофосфорилирование
Нециклическое фотофосфорилирование инициируется светом, падающим на фотосистемы I и II. Возбужденные электроны пигмента Р690 (ФС II) или Р700 (ФС I) восстанавливают соответствующие акцепторы электронов, т. е. X или Y. P690 и Р700 становятся положительно заряженными (т. е. окисленными). Электроны воды возвращают Р690 в нейтральное состояние: они переносятся по "нисходящей" линии от воды на Р690 через переносчик электронов Z, а в качестве побочного продукта фотосинтеза образуется кислород.
Р700 нейтрализуется электронами, движущимися "вниз" от X и далее по цепи переноса электронов, и при этом их энергия используется для синтеза АТФ. В расчете на одну пару электронов может образоваться до двух молекул АТФ, но эта величина, по-видимому, сильно варьирует (на рис. 9.15 показаны две молекулы). В конце концов электроны доходят от Y до НАДФ и взаимодействуют с ионами водорода, образуя НАДФ·Н2. Обратите внимание на то, что при "расщеплении" воды ионы водорода образуются в избытке.
Циклическое фотофосфорилирование
При циклическом фотофосфорилировании электроны от Y снова возвращаются на Р700 по цепи переноса электронов. Так же как и при нециклическом фотофосфорилировании, энергия возбуждения электронов используется для синтеза АТФ.
Основные различия между циклическим и нециклическим фотофосфорилированием показаны в табл. 9.5.
Таблица 9.5. Сравнение циклического и нециклического фотофосфорилирования
Нециклическое фотофосфорилирование описывается следующим суммарным уравнением:
При циклическом фотофосфорилировании могут образовываться дополнительные количества АТФ. Эффективность преобразования энергии при световых реакциях очень высока и составляет около 39%.
Реакция Хилла
В 1939 г. Роберт Хилл, работая в Кембридже, обнаружил, что изолированные хлоропласты способны высвобождать кислород в присутствии окислителя (акцептора электронов). С тех пор эту реакцию называют реакцией Хилла. Природный акцептор электронов — НАДФ — можно заменить другими окислителями (они получили название окислителей Хилла). Один из них — голубой краситель ДХФИФ (2,6-дихлорфенолиндофенол), который обесцвечивается после восстановления:
Опыт 9.1. Исследование реакции Хилла
Листья шпината, салата или капусты
Ножницы
Предварительно охлажденная ступка с пестиком (либо гомогенизатор или бытовой миксер)
Марля или нейлон
Воронка для фильтрования
Центрифуга и центрифужные пробирки
Водяная баня со льдом и солью
Стеклянная палочка
0,05 М фосфатный буфер, рН 7,0
Среда для выделения
Раствор ДХФИФ (реакционная среда)
Для выделения хлоропластов можно взять листья шпината, салата или капусты. Листья заливают холодной средой с нужным рН и подходящей осмотической и ионной силой; годится, например 0,4 М раствор сахарозы с 0,01 М КС1 и 0,05 М фосфатным буфером, рН 7,0. Если вы хотите сохранить биохимическую активность, все растворы и необходимые принадлежности надо предварительно охладить и всю работу проводить на холоде и как можно быстрее. Поэтому сначала хорошо разберитесь в методике, а затем уже подготовьте все оборудование.
Если нет возможностей для самостоятельного получения препаратов каждой группой студентов, этим методом можно выделить достаточное количество хлоропластов сразу для нескольких групп.
1. Измельчите ножницами три небольших листочка шпината, салата или капусты (средние жилки и черешки не берите). Залейте в холодную ступку или стакан гомогенизатора 20 мл охлажденной среды для выделения (если надо, пропорционально увеличьте объем измельченной массы и среды) и бросьте туда измельченные листья.
2. Быстро и энергично разотрите листья в ступке (или гомогенизируйте их около 10 с).
3. Положите на воронку четыре слоя марли или нейлона, смочите холодной средой для выделения.
4. Профильтруйте гомогенат через воронку. Фильтрат соберите в охлажденные центрифужные пробирки, помещенные в водяную баню со льдом и солью. Соберите края марли вместе и тщательно отожмите ее в пробирки.
5. Удостоверьтесь в том, что объем фильтрата во всех пробирках одинаков[32].
6. Если ваша настольная центрифуга имеет всего одну постоянную скорость, центрифугируйте фильтрат в течение 2-5 мин (нужно, чтобы появился небольшой осадок, но время осаждения должно быть минимальным).
Если имеется настольная центрифуга, скорость которой можно менять, центрифугируйте фильтрат 1-2 мин при 100-200 g (g — ускорение силы тяжести). Надосадочную жидкость отцентрифугируйте еще раз в течение 5 мин при 1000-2000 g (этого времени достаточно для получения небольшого осадка хлоропластов).
7. Слейте надосадочную жидкость. Налейте в одну из пробирок примерно 2 мл среды для выделения и ресуспендируйте осадок с помощью стеклянной палочки. Полученную суспензию перелейте во вторую пробирку и повторите ресуспендирование. (Если работают несколько групп студентов, то можно налить во все пробирки по 2 мл среды для выделения и дать каждой группе по одной пробирке.)
8. Полученную суспензию хлоропластов держите в водяной бане со льдом и солью и используйте ее как можно быстрее.
Теперь суспензию хлоропластов можно использовать для изучения реакции Хилла. Раствор ДХФИФ должен быть комнатной температуры. Подготовьте четыре пробирки (1-4) и налейте в них соответственно
1) 0,5 мл суспензии хлоропластов + 5 мл раствора ДХФИФ; оставьте пробирку на ярком свету;
2) 0,5 мл среды для выделения + 5 мл раствора ДХФИФ; оставьте пробирку на ярком свету;
3) 0,5 мл суспензии хлоропластов + 5мл раствора ДХФИФ; сразу же спрячьте в темное место;
4) прилейте к 5 мл дистиллированной воды 0,5 мл суспензии хлоропластов. Эта пробирка послужит цветным стандартом: она покажет, какой должна быть окраска суспензии после полного восстановления ДХФИФ. Через 15-20 мин запишите ваши наблюдения.
Если в лаборатории есть колориметр, то за ходом реакции можно проследить, отмечая уменьшение поглощения света красителем по мере изменения его окраски. В окисленном состоянии краситель синий, а в восстановленном бесцветный. В этом случае пробы 2 и 4 следует приготовлять прямо в кюветах колориметра. Поставьте красный (или желтый) светофильтр и установите прибор на ноль, взяв в качестве контроля кювету с пробой 4. Затем быстро приготовьте пробу 1, снимите для нее показания прибора и поставьте кювету с пробой 1 на яркий свет. Дальнейшие измерения делайте через каждые 30 с. Постройте график хода реакции. Как только реакция закончится, измерьте поглощение пробы 3. Самопроизвольное восстановление красителя можно оценить по пробе 2, при этом для установки колориметра на ноль берут в качестве контроля среду для выделения. В идеале для полного восстановления достаточно 10 мин.
Приготовьте следующие растворы:
0,05 М фосфатный буфер, рН 7,0
Na2HPО4·12Н2О 4,48 г (0,025 М)
КН2РО4 1,70 г (0,025 М)
Доведите дистиллированной водой до 500 мл и поставьте в холодильник (0-4°С).
Среда для выделения
Сахароза 34,23 г (0,4 М)
КС1 0,19 г (0,01 М)
Растворите все в фосфатном буфере при комнатной температуре и доведите буфером до 250 мл. Держите среду в холодильнике при 0-4°С.
Раствор ДХФИФ (реакционная среда)
ДХФИФ 0,007-0,01 г (~ 10-4 М)
КС1 0,93 г (0,05 М)
Растворите в фосфатном буфере при комнатной температуре и доведите объем до 250 мл. Храните в холодильнике при 0-4°С. Используйте при комнатной температуре. (Хлорид калия — кофактор реакции Хилла.)