Деннис Тейлор – Биология. В 3-х томах. Т. 1 (страница 49)

Для этих анализов очень подходит альбумин куриного яйца.

Белки

Витамин С (аскорбиновая кислота)

Данный метод можно при необходимости использовать для количественного определения. В этом случае указанные объемы следует отмерять очень точно. Подходящим источником витамина С может служить свежий апельсиновый или лимонный сок в смеси с дистиллированной водой (1:1). Можно использовать также имеющиеся в продаже таблетки витамина С.

Витамин С (аскорбиновая кислота)[20]

5.20. Как можно определить концентрацию аскорбиновой кислоты в полученной пробе?

5.21. Вам даны три раствора сахара: в одном содержится глюкоза, в другом — смесь глюкозы и сахарозы, в третьем — сахароза.

а) Как вы определите, какой сахар содержится в каждом из этих растворов?

б) Кратко опишите дальнейшие процедуры, с помощью которых можно подтвердить правильность вашего ответа (допустим, что в вашем распоряжении имеется нужный прибор и что время позволяет провести такие определения).

5.22. Как можно приготовить 100 мл 10%-ного раствора глюкозы?

5.23. В вашем распоряжении имеются в качестве исходных растворов 10%-ный раствор глюкозы и 2%-ный раствор сахарозы. Как можно приготовить из них 100 мл смеси с конечной концентрацией 1% сахарозы и 1% глюкозы?

Опыт 5.2. Определение биомолекул в тканях

Биохимику часто приходится выявлять присутствие тех или иных биомолекул в живых тканях или определять их количество (т. е. вести качественный или количественный анализ). Иногда эти определения можно выполнять непосредственно на самой ткани, но нередко им должен предшествовать тот или иной процесс экстракции или очистки.

Полезно потренироваться на каких-нибудь обычных пищевых продуктах или растительном материале, определяя в них те биомолекулы, о которых шла речь в опыте 5.1. Там, где это возможно, мы предлагаем процедуру экстрагирования, которая позволит использовать для анализа чистый бесцветный раствор. Усвоив смысл таких процедур, студент сможет затем при необходимости сам предложить аналогичные методики.

Все, что перечислено в опыте 5.1 (от начала и до раствора ДХФИФ)

Ступка с пестиком

Микроскоп

Предметные и покровные стекла

Лезвие бритвы

Часовое стекло

Раствор Шульца

Флороглюцин + концентрированная соляная кислота

Клубень картофеля

Яблоко

Вата

Одревесневший стебель

Семена/орехи

Намоченный горох

Бобы

Микроскопическое исследование тонких срезов ткани

Метод пригоден для знакомства с теми отложениями запасных веществ, которые можно видеть под микроскопом, например с крахмальными зернами в клубне картофеля.

Микроскопическое исследование срезов с соответствующим окрашиванием или какой-либо иной химической обработкой

Пригодно для выявления перечисленных ниже веществ.

Редуцирующие сахара. Поместить срез в несколько капель реактива Бенедикта и осторожно нагреть до кипения; при необходимости добавить воды, чтобы предотвратить высыхание.

Крахмал. Поместить в разбавленный раствор 12/КΙ.

Белок. Поместить срез в несколько капель реактива Миллона и осторожно нагреть до кипения; при необходимости добавить воды, чтобы предотвратить высыхание.

Масла и жиры. Окрасить исследуемый материал, например семена, Суданом III, после чего промыть водой и (или) 70%-ным спиртом. Приготовить срезы и заключить в среду.

Целлюлоза, лигнин и т. п. Об окрашивании см. Приложение 2.4.2.

Исследование прозрачных водных растворов

Обесцветить ткань, если в этом есть необходимость. Присутствующие в ткани пигменты могут мешать цветным реакциям, но обычно эти пигменты легко удалить из ткани органическими растворителями, например 80%-ным этанолом или 80%-ным пропаном (Беречь от соприкосновения с открытым огнем!). Следует, однако, помнить, что эти растворители могут удалять из ткани липиды и растворимые сахара.

Способ пригоден для извлечения хлорофилла из листьев.

Гомогенизация материала. Сахара и белки. Кусочки предназначенного для исследования материала растереть в кашицу с небольшим количеством воды при помощи ступки или миксера. Растертый материал процедить через несколько слоев тонкой кисеи или нейлона, предварительно смоченных водой, и (или) отфильтровать либо отцентрифугировать для удаления твердых частиц. Это может и не потребоваться, если суспензия окажется высокодисперсной и практически бесцветной. Прозрачный раствор анализируют, как обычно, а если нужно, приготовляют из него соответствующие разведения. Твердый осадок, если он представляет интерес, также может быть подвергнут анализу.

Липиды. Растереть материал, перенести в пробирку и вскипятить. Липиды отделяются в виде капелек масла. Провести окрашивание Суданом III. Можно вместо этого приготовить эмульсию из тонко наструганного ядра ореха или других пищевых продуктов (которые могут быть и окрашенными) и провести эмульсионную пробу.

Описанная методика пригодна для выявления в различных материалах указанных ниже веществ: Фрукты (например, яблоки (витамин С, сахара) или апельсины)

Орехи (масла)

Семена клещевины (масло)

Семена гороха (белок)

Семена сосны (белок, масло)

Картофель (крахмал, витамин С)

Яйца (белок)

Исследуемые материалы можно подразделить на фракции и затем каждую такую фракцию, например семена, мякоть плодов, кожуру или сок, исследовать по отдельности.

Глава 6. Ферменты

Ферменты — это белковые молекулы, синтезируемые живыми клетками. В каждой клетке имеются сотни различных ферментов. С их помощью осуществляются многочисленные химические реакции, которые могут с большой скоростью идти при температурах, подходящих для данного организма, т. е. в пределах от 5 до 40°С. Чтобы эти реакции с той же скоростью протекали вне организма, потребовались бы высокие температуры и резкие изменения некоторых других условий. Для клетки это означало бы гибель, ибо вся работа клетки строится таким образом, чтобы избежать любых сколько-нибудь заметных изменений в нормальных условиях ее существования. Ферменты, следовательно, можно определить как биологические катализаторы, т. е. как вещества, ускоряющие реакции. Они абсолютно необходимы, потому что без них реакции в клетке протекали бы слишком медленно и не могли поддерживать жизнь.

Ферментативные реакции подразделяются на анаболические (реакции синтеза) и катаболические (реакции распада). Совокупность всех этих реакций в живой клетке или в живом организме составляет то, что мы называем метаболизмом. Метаболизм, таким образом, слагается из анаболизма и катаболизма. Примером фермента, участвующего в анаболизме, может служить глутаминсинтетаза:

(АТФ — аденозинтрифосфат; АДФ — аденозиндифосфат; Ф_н — неорганический фосфат). В качестве примера фермента, участвующего в катаболизме, можно назвать мальтазу:

Обычно для того чтобы превратить данное исходное вещество через ряд промежуточных соединений в продукт (или продукты), несколько ферментов действуют последовательно один за другим. Такая последовательность реакций составляет так называемый метаболический путь. В клетке работает одновременно много метаболических путей. Реакции протекают согласованно, подчиняясь строгой регуляции, что объясняется специфической природой ферментов. Один фермент обычно катализирует только одну реакцию. Таким образом, ферменты служат для регулирования происходящих в клетке реакций и обеспечивают надлежащую их скорость.

6.1. Катализ и энергия активации

Биологические катализаторы (т. е. ферменты) характеризуются следующими основными свойствами: все ферменты представляют собой глобулярные белки; они увеличивают скорость реакции, но сами в этой реакции не расходуются; их присутствие не влияет ни на природу, ни на свойства конечного продукта (или продуктов) реакции; очень малое количество фермента вызывает превращение больших количеств субстрата; активность ферментов меняется в зависимости от рН, температуры, давления и от концентраций как субстрата, так и самого фермента; катализируемая реакция обратима; ферменты обладают специфичностью, т. е. один фермент катализирует обычно только одну реакцию.

Представим себе смесь бензина и кислорода. Реакция между этими двумя веществами с термодинамической точки зрения возможна, но она не пойдет без затраты некоторого количества энергии, поступившей, например, в форме простой искры. Энергия, необходимая для того, чтобы заставить субстраты вступить в реакцию, называется энергией активации [Е_а]. Чем больше требуемая энергия активации, тем ниже скорость реакции при данной температуре. Ферменты, действуя как катализаторы, снижают энергию активации, которая требуется для того, чтобы могла произойти реакция (рис. 6.1). Они повышают общую скорость реакции, не изменяя в сколько-нибудь значительной степени температуру, при которой эта реакция протекает.

Рис. 6.1. Энергетические барьеры катализируемой и некатализируемой реакций (см. также приложение 1)