Деннис Тейлор – Биология. В 3-х томах. Т. 1 (страница 11)
Опыт 2.2. Окрашивание бактерий для изучения их с помощью светового микроскопа
Фазово-контрастный микроскоп позволяет видеть живые клетки, однако чаще все же клетки предварительно фиксируют и окрашивают. Одна из основных методик окрашивания, позволяющая идентифицировать бактерии, — это методика окрашивания по Граму. Этот метод разработал в 1884 г. датский врач Христиан Грам. До окрашивания все клетки бесцветны. После окрашивания грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый, а грамотрицательные — в красный цвет. Мы уже говорили в разд. 2.2.2 ("Клеточная стенка"), чем эти бактерии отличаются друг от друга.
Основной краситель — кристаллический фиолетовый (0,5%-ный водный раствор)
Раствор Люголя
Ацетон — спирт (ацетон: абсолютный спирт в соотношении 50:50) для отмывания красителя
Сафранин (1%-ный водный раствор) для контрастирования
Проволочная петля
Бунзеновская горелка
Тщательно вымытые предметные стекла (протереть спиртом)
Пинцет
Штатив для окрашивания, пристроенный над кюветой или чашкой
Промывалка с дистиллированной водой
Фильтровальная бумага
Иммерсионное масло и микроскоп с иммерсионным объективом
(Стадии 1-6 должны занять не более 5 мин.) (Из кн.: Bacteriology, Humphries, J., John Murray, 1974.)
1. Приготовьте мазок бактерий на предметном стекле. Для этого прокалите проволочную петлю в пламени горелки и охладите ее. Капните 1-2 капли водопроводной воды в центр чистого стекла. Слегка коснитесь петлей выбранной вами бактериальной колонии, полученной в предыдущем опыте; чтобы не загрязнить культуру, чашку приоткрывайте как можно меньше. Перенесите клетки на предметное стекло и осторожно помешайте каплю петлей. Размажьте клетки в виде тонкой пленки по стеклу, чтобы получилось пятно площадью около 3×1 см. Снова прокалите петлю. Очень важно добиться нужной толщины мазка. Мазок должен чуть-чуть опалесцировать и чаще оказывается слишком толстым, а не слишком тонким. Необходимо также, чтобы толщина мазка по всей поверхности была одинакова. Дайте мазку полностью высохнуть на воздухе (несколько минут).
2. Зафиксируйте мазок. Возьмите стекло пинцетом и в горизонтальном положении проведите его три раза через желтую часть пламени горелки. Очень важно не перегреть стекло. Простейший способ проверки правильности нагрева — после каждого проведения через пламя слегка коснуться стеклом руки. Если неприятного ощущения нет, то все делается верно. При фиксации бактериальные клетки гибнут в результате коагуляции цитоплазмы; кроме того, клетки прилипают к стеклу.
3. При окрашивании очень легко запачкать стол, поэтому процедуру лучше проводить на штативе, пристроенном над кюветой или кристаллизатором. Штатив можно сделать из двух стеклянных или металлических палочек, положенных строго горизонтально на края кюветы или кристаллизатора на расстоянии 5 см друг от друга. Всю систему проще всего настроить, если закрепить палочки пластилином. Залейте стекло раствором кристаллического фиолетового и оставьте на 30 с.
4. Смойте краситель раствором Люголя; залейте стекло этим раствором и оставьте на 30 с. Смойте йод дистиллированной водой из промывалки.
5. Промойте стекло смесью ацетона со спиртом, пока не перестанет отходить краситель (примерно 3 с); после этого немедленно промойте стекло водой, чтобы препарат совсем не обесцветился. Если нужно, повторите эту процедуру (умение определять продолжительность отмывки приходит с опытом).
6. Залейте стекло сафранином и оставьте на 1 мин. Отмойте краситель водой. Осторожно просушите стекло между слоями чистой фильтровальной бумаги и дайте ему окончательно высохнуть на воздухе.
7. Капните на мазок каплю иммерсионного масла и рассмотрите препарат с помощью иммерсионного объектива (разд. П.2.3.2).
Совпадают ли ваши наблюдения с тем, что написано в разд. 2.7.1 о численности бактерий в молоке?
Опыт 2.3. Сравнение численности бактерий в свежем и несвежем молоке
Если одиночную клетку бактерии поместить на питательный агар, она образует целую колонию, которая в отличие от исходной клетки видна невооруженным глазом. Этим можно воспользоваться для подсчета бактерий.
Простерилизуйте оборудование. Первая часть опыта основана на использовании метода серийных разведений. Число бактерий в молоке огромно, поэтому для подсчета удобнее брать пробу небольшого объема и разводить ее в известное число раз. Готовят серию разведений. Во второй части опыта из каждого разведения берут пробу для выращивания. Для подсчета числа бактерий в конкретном объеме молока используют ту пробу, где после выращивания на агаре получается наиболее подходящее число колоний (достаточно большое, но при этом отдельные колонии не перекрывают друг друга).
Шесть стерильных чашек с питательным агаром
Восемь градуированных пипеток на 1 см3
Градуированная пипетка на 10 см3
Шесть пробирок и штатив для них
Вата
Несмываемые чернила
Бунзеновская горелка
100 см3 дистиллированной воды
Свежее молоко
Несвежее молоко
70%-ный спирт
Алюминиевая фольга
Стеклянный шпатель
1. Все шесть пробирок закройте ватными пробками, обернутыми алюминиевой фольгой.
2. Все восемь градуированных пипеток на 1 см3 и одну градуированную пипетку на 10 см3 закройте сверху небольшим комочком ваты и заверните каждую пипетку отдельно в алюминиевую фольгу.
3. Положите пробирки и пипетки в суховоздушный термостат, нагретый до 160°С, и оставьте их там на 60 мин. (В таком термостате нельзя стерилизовать бутыли со средой и водой.)
4. Перед использованием дайте оборудованию остыть.
1. Подпишите шесть стерильных, закрытых пробками пробирок, пометив их C1, C2, С3 и H1, H2, Н3. Снимите с пробок обертку из фольги.
2. Подпишите снизу шесть стерильных чашек с питательным агаром, обозначив их C1, C2, С3 и H1, H2, Н3.
3. В каждую из шести пробирок внесите по 9,9 см3 стерильной дистиллированной воды. Для этого воспользуйтесь следующими приемами.
а) Мизинцем и безымянным пальцем одной руки зажмите ватную пробку колбы со стерильной дистиллированной водой и выньте ее из колбы.
б) Одной рукой держите колбу и пробку, а в другую возьмите стерильную пипетку на 10 см3 и наберите из колбы 9,9 см3 стерильной дистиллированной воды.
в) Закройте колбу пробкой.
г) Точно таким же способом, как в пункте а, выньте пробку из первой пробирки.
д) Перенесите 9,9 см3 воды в эту пробирку.
е) Закройте пробирку пробкой.
ж) Проделайте эту же операцию с остальными пятью пробирками.
4. Хорошо встряхните пробу свежего молока и, взяв стерильную пипетку на 1 см3, перенесите 0,1 см3 такого молока в пробирку С1. Пробку вынимают и помещают обратно так же, как и раньше. Получается разведение в 100 раз.
5. Чтобы проба хорошо перемешалась, осторожно встряхните пробирку.
6. Возьмите новую пипетку и перенесите 0,1 см3 из пробирки С1 на стерильную чашку, помеченную С1, лишь слегка приподнимая крышку чашки.
7. Простерилизуйте стеклянный шпатель; для этого окуните его в 70%-ный спирт, дайте избытку спирта стечь и затем подержите вертикально в пламени бунзеновской горелки.
8. Дайте шпателю остыть и холодным шпателем размажьте пробу по поверхности чашки.
9. Снова простерилизуйте шпатель.
10. Взяв ту же пипетку, что использовалась в п. 6, перенесите 0,1 см3 из пробирки С1 в пробирку С2, вынимая и возвращая ватные пробки на место, как указано выше.
11. Чтобы проба хорошо перемешалась, встряхните пробирку С2. Получается разведение в 10000 раз.
12. Повторите все операции, начиная с п. 6 и кончая п. 9, взяв вместо С1 пробирку С2.
13. Повторите операции пп. 10 и 11, взяв С3 вместо С2. Это даст нам разведение в 1000000 раз. Повторите операции пп. 6-9, взяв С3 вместо С1.
14. Тем же методом посева штрихом приготовьте пробы несвежего молока, взяв чашки H1, H2 и Н3.
15. Переверните приготовленные чашки (шесть штук) вверх дном и поставьте примерно на 3 сут. в термостат при 35°С.