Магдалена Зерницка-Гетц – Танец жизни. Новая наука о том, как клетка становится человеком (страница 23)

С помощью моих коллег по лаборатории Симы Гревола, Сэма Морриса и Флоренс Барриос, а также Самира Патанкара и Ли Баттери из команды Кевина (фармацевтическая школа Ноттингемского университета) у нас получилось создать такие условия среды, которые каким-то образом «убеждали» эмбрион, что имплантация прошла успешно. Он продолжал развиваться и начинал увеличиваться в размерах.

Когда уже имеются знания, процесс кажется легким, но изначально на подбор правильной комбинации факторов для культивирования мышиных эмбрионов после стадии имплантации у Симы ушли месяцы ежедневных попыток. И даже когда у нас получилось, нам надо было сделать метод воспроизводимым, что, разумеется, вышло не сразу. Сегодня эксперимент работал, завтра нет. Это наводило на мысль, что условия среды были недостаточно стабильными. Работа по поиску причин и исправлению ошибок занимала много времени.

Проблему создавал и гидрогель, покрывающий дно чашки Петри. Он мешал снимать фильм в высоком разрешении. Это подрывало весь замысел проекта, состоящий в том, чтобы следить за прогрессом клеток, пока те сотрудничают друг с другом ради осуществления морфогенеза.

Со временем мы поняли, что гель нам не нужен. Достаточно было установить правильную среду, побуждающую эмбрионы расти in vitro[17], и они прикреплялись к самой пластиковой чашке. Мы использовали особые чашки, прозрачные и с оптическими свойствами, позволяющими делать сквозь них высококачественные снимки эмбрионов. В первую очередь мы хотели установить, как эмбрион закладывает свою передне-заднюю ось (голова — хвост). Многие ученые из моей области, включая меня саму, пытались разобраться в развитии данной оси, и вот впервые в жизни мы могли непосредственно наблюдать за тем, как это происходит.

Более ранняя работа Розы Беддингтон показала, что формирование передней части тела контролируется сигналом, поступающим от специализированной популяции клеток, потомков примитивной энтодермы [10]. Эта группа клеток называется передней висцеральной энтодермой (anterior visceral endoderm), или просто AVE, и если у нее не получится выработать сигнальный белок, эмбрион останется без головы. Развитие AVE происходит тогда, когда бластоциста превращается в цилиндрическую структуру, и мы первый раз в жизни могли наблюдать за этим процессом. Для образования головы нужен белок-ингибитор Cerberus (Цербер), поэтому мы использовали трансгенный эмбрион, у которого активность Cerberus сопровождалась свечением GFP (созданным еще в те годы, когда я была постдоком у Мартина Эванса).

Мы обнаружили интересный факт: по мере развития эмбриона некоторым клеткам суждено сформировать AVE, в то время как другие лишь индуцированы на то, чтобы превратиться в нее позже. Обе группы клеток собираются вместе на дне эмбриона и мигрируют на одну сторону. Перемещаясь, они сигнализируют соседнему эпибласту стать той частью эмбриона, где в будущем появится голова. Согласно нашим результатам, AVE, вероятно, происходит из двух наборов предшественников, один из которых обнаруживается уже во время нарушения симметрии на стадии бластоцисты [11]. Полученный результат подчеркивает важность событий до имплантации эмбриона, способных влиять на формирование организма на более поздних стадиях.

С противоположной от AVE стороны активируется ген Brachyury и приступает к созданию белка. Активность этого гена символизирует появление задней части эмбриона, образование мезодермы и гаструляцию. Взглянув на скрытые процессы имплантации в культуре, мы смогли проследить, какие из генов и в какой последовательности активировались на этапе, когда эмбрион создает свою передне-заднюю ось. У нас получилось сделать фильмы, которые демонстрировали хореографию клеток, ведущую к гаструляции. Эта информация была для меня чрезвычайно важна — казалось, будто каждая клеточка в моем теле улыбалась. К нашему удивлению, эту первую в мире визуализацию развития имплантирующегося эмбриона в культуре, отражающую ранние этапы формирования AVE, рецензенты Nature публиковать отказались (и, как водится, один из них выступил против идеи о том, что раннее нарушение симметрии влияет на формирование AVE). Зато журнал Nature Communications оценил наше открытие и опубликовал исследование в 2012 году [12].

Потребовались еще два года усердной работы, чтобы прояснить каждый шаг морфогенеза эмбриона на стадии имплантации. Тем временем два члена моей команды, Иван Беджов и Сай Люнг, усовершенствовали химию питательной среды. Наш метод культивирования позволил нам обнаружить, что во время имплантации архитектура эмбрионов меняется радикальным и неожиданным образом [13]. Три типа клеток, составляющих бластоцисту, перестраиваются в новую конфигурацию. Меняя форму шара на форму чаши, эпибласт превращается в красивую трехмерную розетку из клинообразных клеток. Затем в центре розетки образуется отверстие (или люмен) и расширяется с образованием полости, в которой позже будет находиться развивающийся плод. Могло ли это быть искусственным последствием метода культивирования in vitro? Анализируя эмбрионы, развивающиеся in vivo, Иван подтвердил, что аналогичная клеточная хореография происходит во время реального имплантационного эмбриогенеза в теле мыши.

По результатам экспериментов, выполненных в прошлом на моделях из стволовых клеток (когда культивирование эмбрионов было невозможно), отверстие эпибласта образуется путем апоптоза — клеточного самоубийства. Прямо как Микеланджело, обтесывающий мраморную глыбу, чтобы создать скульптуру Давида, апоптоз придает форму частям тела и органам. Когда клетка проходит через апоптоз, ее ядро конденсируется, а набор специальных ферментов режет ДНК на куски.

Но, как ни странно, вовсе не апоптоз открывает просвет в мышином эмбрионе. Вместо него на стадии имплантации мы видим потрясающий пример самоорганизации (in vitro и in vivo), при которой клетки благодаря контакту с внеклеточным матриксом приобретают полярность. Вследствие асимметричного перераспределения клеточного содержимого (включая среди прочего уже знакомые PAR-белки) каждая клетка приобретает разные концы — апикальный и базальный. Все клетки сходятся своими апикальными концами, а затем расслабляются, секретируя специфические белки, из-за которых отверстие расширяется в целый просвет.

Как я уже говорила, моя коллега по лаборатории Анна Хупаловская не только ученый, но и художник, поэтому я попросила ее проиллюстрировать формирование этой 3D-розеточной структуры, чтобы я могла показывать ее на лекциях. Анна придумала прекрасную 2D-аналогию, уподобив ее синхронному плаванию, где случайно распределенные пловцы (символизирующие клетки эпибласта) собираются вместе (поляризуются) с образованием розетки. При таком расположении клеток конкретные субклеточные структуры обращаются внутрь и секретируют жидкость, чтобы затопить полость и расширить розетку до появления так называемой проамниотической полости — это похоже на пончик с отверстием в центре. Процесс имеет прелестное название «люменогенез». Без люменогенеза эмбрион абортируется.

Самоорганизация человеческого эмбриона

Следующий шаг мог показаться очевидным — воспользоваться методом культивирования эмбрионов на стадии имплантации, чтобы выяснить, что происходит на этой стадии во время нашего собственного онтогенеза. Выглядим ли мы на седьмой день развития как живая розетка из клеток-лепестков, окружающих отверстие, которое в будущем станет временным домом для проточеловека? Похожи ли мы в начале жизни на крошечные «цветы»?

Человеческим эмбрионам требуется особое внимание и забота, о чем я подробнее расскажу в главе 10. На работу с человеческим материалом необходимы лицензии, получение которых — дело серьезное, и по понятным причинам. Чтобы установить, стоит ли вкладывать такие крупные инвестиции, а также проверить, есть ли у нас хоть какой-то шанс на успех, мы провели пилотное исследование в другой лаборатории, у которой имелось необходимое разрешение.

Наша первая попытка культивировать человеческий эмбрион за пределами стадии имплантации произошла в мае 2013 года с использованием всего двух эмбрионов. Поразительно, но метод сработал, и один из эмбрионов начал расти и развиваться.

Новости о нашем успехе пришли в один из тех изумительных дней, которые случаются нечасто. Агнешка позвонила мне, когда я готовила с Дэвидом и Саймоном на кухне, и спросила, можем ли мы прекратить эксперимент — шел одиннадцатый день. Мы решили продлить его еще на сутки. Я была так возбуждена, что в ту ночь не сомкнула глаз.

Маленький шарик из клеток успешно развивался до двенадцатого дня. Это было в два раза дольше, чем обычно, и, насколько я знаю, это был самый первый человеческий эмбрион, который так долго развивался в лабораторных условиях. Он вселил надежду на то, что однажды мы сможем с помощью нашего метода получить новую информацию и углубить наше представление о начале человеческой жизни, а также решить проблему выкидышей. Многим интересно, праздновали ли мы это событие. Нет, на данном этапе это было бы слишком преждевременно. Для успеха нам требовалось не только сделать метод воспроизводимым, но и найти с его помощью что-нибудь значительное. Тем не менее я была так счастлива, что несколько дней не могла думать ни о чем другом.