Дмитрий Павлов – Биотехнология в защите растений. Практикум по выполнению лабораторных работ (страница 1)

Д. А. Павлов, М. В. Добронравова, Е. В. Ченикалова

Биотехнология в защите растений. Практикум по выполнению лабораторных работ

© ФГБОУ ВПО Ставропольский государственный аграрный университет, 2013

Введение

Научной основой биотехнологии являются принципы биохимии и микробиологии, молекулярной (клеточной) биологии и генетики, а также других смежных биологических дисциплин: растениеводства и селекции, энтомологии и фитопатологии, зоологии и экологии, охраны окружающей среды.

Практическое значение и конечный итог деятельности сельскохозяйственной биотехнологии как научно-практической отрасли биологии заключается в промышленном получении ценных продуктов сельскохозяйственного производства для медицины, питания, промышленности, поддержания гомеостаза среды существования человечества.

В результате изучения дисциплины студенты агрономического факультета должны знать теоретические основы сельскохозяйственной биотехнологии – принципы генной инженерии, культивирования «in vitro» органов, тканей, клеток и изолированных протопластов высших растений, использования гормонов растений и животных; методы диагностики фитопатогенных вирусов; технологию получения микробиологических препаратов для борьбы с вредными организмами; принципы использования полезных макро- и микроорганизмов в области защиты растений и охраны окружающей среды.

Студенты должны ознакомиться с технологией мелкотоннажного производства микробиопрепаратов для защиты растений от вредителей и болезней; технологиями массового разведения трихограммы, габробракона, энкарзии, хищной галлицы афидимизы, фитосейулюса и других энтомофагов; использованием дождевых червей и комнатных мух для переработки органических отходов и производства биогумуса.

Лабораторная работа № 1. Определение титра грибных препаратов

Цель работы: освоить методику определения титра биопрепаратов.

Материалы и оборудование: сухой или смачивающийся порошок боверина или жидкий препарат из биолаборатории. Набор пробирок для разведения препаратов, стеклянные палочки, мерные пипетки, колбы, камера Горяева, микроскопы, фильтровальная бумага.

При применении грибных и бактериальных биологических препаратов для защиты растений от вредителей и болезней важно следить за тем, чтобы титр рабочей суспензии соответствовал рекомендуемому (рис. 1).

Рис. 1. Энтомопатогенные грибы:

а) конидиеносцы гриба рода энтомофтора (Entomophthora sp.);

б) конидиеносцы и конидии гриба боверия (Beauveria sp.);

в) колорадский жук, пораженный мускардинозом

Титром называют количество спор гриба, находящегося в 1 мл суспензии или в 1 г сухого порошка (Бондаренко, 1983).

Особенно важно контролировать титр препарата при его изготовлении мелкими партиями в условиях производственных биолабораторий станции защиты растений.

Определение титра препарата, приготовленного на жидкой среде. Полученную из биолаборатории культуру гриба (жидкий препарат) предварительно просматривают под микроскопом для визуального определения степени насыщения конидиоспорами. При обильном спороношении полученную суспензию разбавляют в 10 и 100 раз, для чего в мерные колбы берут пипеткой по 1 мл хорошо перемешанной суспензии и доводят водой до объема 10 и 100 мл соответственно. Затем содержимое исследуемой суспензии еще раз встряхивают, стеклянной палочкой по капле наносят на две площадки камеры Горяева, покрывают покровным стеклом и хорошо притирают. Излишки жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Камеру помещают на предметный столик, при окуляре 10x и объективе 10x находят средний ряд квадратов сетки, переводят объектив на увеличение 40х и подсчитывают число конидий. Подсчет проводят в 10 больших квадратах камеры, расположенных в среднем ряду сетки, пропустив при этом 2 первых и 2 последних квадрата. Если число конидий в большом квадрате превышает 50, для анализа берут суспензию с более высоким разведением или разбавляют в 10 раз последний вариант разбавленной суспензии.

Вычислив среднее арифметическое числа конидий в одном большом квадрате, подставляют его в формулу для определения титра (Т) маточной культуры по формуле

Т = 25 х 104 х A х P,

где А – среднеарифметическое число конидий в большом квадрате;

Р – разведение (10, 100 и т. д).

Определение титра суспензии сухого препарата. Исходя из рекомендуемой нормы применения сухого препарата, например, 1 кг/га при разведении 300 л рабочего раствора, готовят суспензию 3,3 г препарата в 1 л воды в колбе, тщательно перемешивают, фильтруют через 2 слоя марли. Полученную суспензию препарата, аналогичную применяемой в производственных условиях, подвергают анализу. Определение титра препарата проводим как в предыдущем случае.

Контрольные вопросы и задания:

1. С какой целью определяют титр грибных препаратов?

2. Опишите устройство камеры Горяева и работу с ней.

3. Расскажите о порядке работы при разведении препаратов и определении разведения.

4. По какой формуле определяется титр препарата? Что означают члены уравнения?

Лабораторная работа № 2. Технология получения и применения биопрепаратов для защиты растений от вредителей

Цель работы: ознакомиться с технологией производства и зарисовать блок-схемы получения бактериальных, грибных и вирусных препаратов, записать технологию их получения и применения.

Материалы и оборудование: образцы микробиологических препаратов, применяемых в защите растений. Насекомые, пораженные грибами, вирусными и бактериальными болезнями. Блок-схемы технологий получения препаратов.

2.1. Получение бактериальных препаратов

Промышленное производство биопрепаратов бактериального происхождения заключается в глубинном культивировании энтомопатогенных бактерий с целью получения максимального титра клеток в культуральной жидкости и накопления токсинов. Промышленные штаммы бактерий должны отвечать следующим требованиям: относиться к определенному серотипу (одному из 12 серотипов и 15 вариантов Δ-эндотоксина Bacillus thuringiensis Berl.), иметь высокую вирулентность и репродуктивность, среднюю чувствительность к комплексу бактериофагов, обеспечивать высокую эффективность биопрепарата. Технология производства всех бактериальных препаратов на основе В. thuringiensis Berl. включает следующие стадии:

1) выращивание посевного материала в лаборатории и посевном аппарате;

2) культивирование в промышленном ферментере;

3) концентрирование культуральной жидкости;

4) сушка, стандартизация и фасовка готового препарата.

Бактерии для создания препарата выращивают сначала в 3-литровых колбах (банках) с искусственной питательной средой (ИПС), а затем в посевном аппарате в условиях аэрации (0,2 л воздуха на 1 л среды в 1 мин).

Посевной материал должен содержать не менее 1,7х10⁹ спор в 1 мл. В посевной аппарат культура добавляется в количестве 0,05 % от объема питательной среды аппарата. Температура культивирования – 28–30 °С, продолжительность культивирования – 35–40 ч.

Состав искусственной питательной среды в посевном аппарате и промышленном ферментере следующий: кормовые дрожжи (2–3 %), кукурузная мука (1–1,5 %), кашалотовый (рыбий) жир (1 %). При этом культуру доводят до стадии споруляции (образования спор у 90–95 % бактериальных клеток) (рис. 2). Если споры не требуются, то среда составляется из глюкозы технической (0,7 %), кукурузного экстракта (4 %), хлорида натрия (2 %). Состав среды влияет на соотношение спор и кристаллов эндотоксина бактерии в культуральной жидкости.

Процесс культивирования заканчивают при степени споруляции 90–95 % и титре спор в 1 мг не менее 1х10⁹.

Готовую культуральную жидкость перекачивают в стерильный сборник, передают на сепарацию и получают пасту влажностью 85 % с выходом около 100 кг из 1 м³ культуральной жидкости и титром 20х10⁹ спор в 1 г пасты.

Пасту собирают в отдельном сборнике. Отцентрифугированную питательную среду при необходимости используют еще 1–2 раза (многократное повторное использование его невозможно, так как в культуральной жидкости накапливаются вещества, тормозящие развитие бактерий). В дальнейшем фугат используют для производства кормовых дрожжей (цикл производства замкнутый, что важно с точки зрения экономичности и охраны окружающей среды).

Пасту направляют на приготовление стабилизированной пасты или сухого смачивающегося порошка – конечных препаративных форм биопрепарата.

Рис. 2. Энтомопатогенная бактерия

Bacillus thuringiensis Berl.:

1 – бактериальная клетка в фазе созревания; 2 – спора бактерии; 3 – Δ-эндотоксин в форме кристаллического включения в бактериальной клетке

Для получения смачивающегося порошка пасту высушивают на распылительной сушилке до остаточной влажности 10 %, смешивают с каолином до стандарта – 30х10⁹ спор в 1 г препарата. Порошок фасуют в 4-слойные герметичные мешки по 20 кг.

Стабилизированную пасту готовят, смешивая ее после сепарации с карбоксиметилцеллюлозой (КМЦ). Молекулы КМЦ, имеющие положительный заряд, за счет электростатических сил собирают на себе кристаллы и споры, заряжая их отрицательно, что способствует равномерному распределению активного начала во всем объеме пасты. Добавляют также консерванты, распределяющиеся равномерно между частицами (рис. 3).

Рис. 3. Блок-схема производства бактериальных препаратов: