Деннис Тейлор – Биология. В 3-х томах. Т. 3 (страница 68)

Эксперименты Бидла и Татума состояли в следующем.

1. Конидии подвергали рентгеновскому облучению, чтобы повысить частоту мутаций.

2. Облученные конидии переносили на полную среду (содержащую все аминокислоты и витамины, необходимые для нормального роста) и выращивали на ней.

3. Образовавшиеся мицелии скрещивали с мицелиями, развившимися из конидий, не подвергнутых рентгеновскому облучению ("дикий тип").

4. Образующиеся аски содержали по четыре аскоспоры от каждого из родительских штаммов (мутантного и дикого типа).

5. Аскоспоры извлекали из асков и выращивали по отдельности на полной питательной среде.

6. Пробы мицелиев помещали на обогащенную витаминами минимальную среду. В некоторых случаях роста не наблюдалось.

7. Штаммы, которые не росли, не были способны синтезировать некоторые аминокислоты. Для того чтобы определить, какие это были аминокислоты, эти штаммы переносили на ряд минимальных сред, к каждой из которых добавлялась какая-либо одна аминокислота.

8. Если данный штамм рос на определенной среде, то, следовательно, эта среда содержала ту аминокислоту, которую данный штамм синтезировать не способен. Таким образом были идентифицйрованы мутантные штаммы нейроспоры. Анализ полученных результатов показал, что во всех случаях, в которых половина аскоспор из данного аска давала мутантный штамм, другая половина была способна расти на минимальной среде.

Эти результаты указывали на то, что мутантный ген ведет себя как единичный рецессивный ген и наследуется в соответствии с законами Менделя. Бидл и Татум пришли к выводу, что в каждом случае рентгеновские лучи вызывали мутацию одного гена, контролирующего синтез одного фермента, необходимого для синтеза одной аминокислоты. Это легло в основу их гипотезы "один ген — один фермент" (рис. 22.19).

Рис. 22.19. Схема, иллюстрирующая главные этапы в идентификации мутантных аллелей, которые контролируют синтез ферментов, участвующих в образовании аминокислот. Подробности см. в тексте (цифры на схеме соответствуют цифрам в тексте)

В этих ранних исследованиях был разработан экспериментальный метод с использованием минимальных сред, применяемый в генетике микроорганизмов во многих модификациях и давший огромное количество информации о роли генов.

В настоящее время твердо установлено, что гены контролируют происходящие в клетке процессы путем синтеза ферментов и других белков. Эти ферменты в свою очередь определяют синтез всех прочих веществ клетки.

С течением времени, однако, определение гена было видоизменено. Работы по строению генов бактериофага Т₄, проведенные Бензером в 1955 г., привели к созданию концепции цистрона как единицы функции. Цистрон — это участок ДНК, несущий информацию, необходимую для синтеза одной полипептидной цепи; такая цепь может функционировать самостоятельно как биологически активная белковая молекула или становится частью более крупной макромолекулы. В настоящее время концепцию "один ген — один фермент" сменила концепция "один цистрон один полипептид".

22.5.2. Генетический код

Когда Уотсон и Крик в 1953 г. предложили модель структуры ДНК в виде двойной спирали, они высказали также предположение, что генетическая информация, передаваемая из поколения в поколение и определяющая метаболизм клетки, заключена в последовательности оснований молекулы ДНК. После того как было установлено, что ДНК кодирует синтез белковых молекул, стало ясно, что последовательность оснований в нуклеотидах ДНК должна определять аминокислотную последовательность белков. Эта зависимость между основаниями и аминокислотами известна код названием генетического кода. Оставалось показать, что нуклеотидный код в самом деле существует, расшифровать его и выяснить, каким образом он переводится в аминокислотную последовательность белковой молекулы.

22.5.3. Структура кода

Молекула ДНК построена из нуклеотидов четырех типов, в состав которых входят четыре разных основания: аденин (А), гуанин (Г), тимин (Т) и цитозин (Ц) (см. разд. 5.6). Нуклеотиды соединены в полинуклеотидную цепь; их обозначают начальными буквами названий соответствующих оснований. С помощью этого четырехбуквенного алфавита записаны инструкции для синтеза потенциально бесконечного числа различных белковых молекул. Если бы одно основание определяло положение одной аминокислоты в первичной структуре какого-то белка, то этот белок мог бы содержать только четыре вида аминокислот. Если бы каждая аминокислота кодировалась двумя основаниями, то с помощью такого кода можно было бы определить 16 аминокислот.

22.3. Составьте список 16 возможных попарных сочетаний из оснований А, Г, Т и Ц.

Только код, состоящий из троек оснований (триплетов), мог бы обеспечить включение в белковые молекулы всех 20 аминокислот. В такой код входит 64 разных триплета.

22.4. Четыре основания, используемые по одному, позволяют закодировать четыре аминокислоты; используемые попарно-16 аминокислот; используемые по три-64 аминокислоты. Выведите математическое выражение, объясняющее это.

Доказательства триплетности кода представил Фрэнсис Крик в 1961 г., получив у фагов Т4 мутации, вызванные добавлением или выпадением оснований. Эти добавления и выпадения, приводящие к сдвигам рамки при "чтении" кода (рис. 22.20), проявились у фагов Т₄ в изменениях фенотипа. В результате сдвига рамки получались такие последовательности триплетов оснований, которые не могли обеспечить синтез белковых молекул с прежней последовательностью аминокислот (прежней первичной структурой). Только добавление или удаление одного основания в определенных точках могло привести к восстановлению правильного кода. Восстановление первоначальной последовательности оснований предотвращало появление мутантов. Эти эксперименты показали также, что триплеты не перекрываются, т.е. каждое основание может принадлежать только одному триплету. Ни одно из оснований, входящих в данный триплет, не является частью другого триплета (рис. 22.21).

Рис. 22.20. Схема, поясняющая результаты добавления или удаления оснований в триплетном коде. Добавление основания Ц приводит к сдвигу рамки, так что первоначальное сообщение ГAT, ГAT, ... превращается в ТГА, ТГА. ... Выпадение основания А вызывает сдвиг рамки, приводящий к замене первоначального сообщения ГAT, ГAT, ... на ATГ, ATГ, ... Добавление основания Ц и удаление основания А в точках, указанных на схеме, приводят к восстановлению первоначального сообщения ГAT, ГAT, ... (По F.H. С. Crick, 1962, The genetic cod I, Scientific American, Offprint N123, Wm. Saunders and Co.)

Рис. 22.21. Триплеты оснований в неперекрывающемся и перекрывающемся кодах

22.5. Используя повторяющиеся триплеты ГТА и основание Ц, покажите, что исходную последовательность триплетов можно восстановить только путем добавления или удаления трех оснований. (Представьте свой ответ в такой форме, как показано на рис. 22.20.)

22.5.4. Расшифровка кода

Для того чтобы понять ход экспериментов, проводившихся с целью установить, какие триплеты соответствуют тем или иным аминокислотам (т.е. расшифровать генетический код), нужно иметь представление о механизме, с помощью которого триплетный код переводится в структуру белковой молекулы.

В синтезе белка участвуют нуклеиновые кислоты двух типовь — дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновая кислота (РНК), взаимодействующие друг с другом. Существует три главных типа РНК: информационная, или матричная, РНК (мРНК), рибосомная РНК (рРНК) и транспортная РНК (тРНК)[10]. ДНК содержится и в таких органеллах, как митохондрии и хлоропласты, но в основном она сосредоточена в ядре, где ее нуклеотидная последовательность копируется (транскрибируется) с образованием матричной РНК (мРНК), переходящей из ядра в цитоплазму. Оказавшись в цитоплазме, нить мРНК прикрепляется к рибосомам, где нуклеотидная последовательность мРНК транслируется в аминокислотную последовательность белка. Каждая аминокислота связывается с соответствующей тРНК, которая присоединяется к комплементарному триплету оснований мРНК. Аминокислоты, оказавшиеся в результате этого друг подле друга, соединяются, образуя полипептидную цепь. Таким образом, для белкового синтеза необходимы ДНК, мРНК, рибосомы, тРНК, аминокислоты, АТФ и ГТФ как источники энергии и различные ферменты и кофакторы, катализирующие каждую стадию этого процесса.

Ниренберг использовал эти данные и различные методы, созданные в конце пятидесятых годов, для разработки ряда экспериментов, поставленных с целью расшифровки кода. Суть его экспериментов сводилась к тому, чтобы, используя мРНК с заранее известной последовательностью оснований, выяснить последовательность аминокислот в полипептидной цепи, синтезируемой в присутствии этой мРНК. Ниренбергу удалось синтезировать РНК (полирибонуклеотид), состоящую из многократно повторяющихся триплетов УУУ. Это соединение, названное полиуридиловой кислотой (поли-У), было использовано в качестве мРНК. В каждую из 20 пробирок поместили бесклеточный экстракт Е. coli, содержавший рибосомы, тРНК, АТФ, ГТФ, ферменты и какую-либо одну меченую аминокислоту. Затем в каждую пробирку добавили поли-У и оставили на некоторое время, чтобы произошел синтез полипептидов. Анализ содержимого пробирок показал, что полипептид образовался только в той пробирке, которая содержала аминокислоту фенилаланин. Это было первым шагом в расшифровке генетического кода: выяснилось, что входящий в мРНК триплет оснований, или кодон, УУУ определяет включение в полипептидную цепь фенилаланина. Затем Ниренберг и его сотрудники занялись получением синтетических полинуклеотидов, соответствующих всем 64 возможным кодонам, и к 1964 г. расшифровали коды для всех 20 аминокислот (табл. 22.4).