А. Максимова – Аллерген-специфическая иммунотерапия у детей (на правах руководства). Согласительный документ Ассоциации детских аллергологов и иммунологов России (страница 11)
Необходимость оценки активности аллергена на этапе лечения несомненна. На стадии производства важность стандартизации связана со следующими факторами:
• сильная зависимость активности и терапевтической эффективности от первоначального качества натурального сырья (сбор в естественных условиях или собственное производство, степень загрязненности другими биологическими видами).
• особенности технологии изготовления и очистки продукта у различных производителей, что делает затруднительным прямое сравнение аллергенов по массе, которое широко используется в традиционной фармакологической промышленности.
• опасность разрушения белков и потери аллергенности при производстве и транспортировке: очистка, замораживание, лиофилизация могут разрушать часть нестабильных эпитопов.
Все вышеперечисленное делает необходимым стандартизацию аллергена – приведение препарата к некоторому эталону, либо выражение его аллергенности (иммуногенности – способности вызывать иммунный ответ) в общепринятых единицах. Всеобщая стандартизация аллергенов могла бы позволить косвенно оценить активность лекарственного аллергена, оценить риски и предполагаемую пользу от его применения, а также не допустить появления препаратов неэффективных или ненадлежащего качества.
За время производства аллергенов был сделан ряд попыток прийти к референсу. Первоначально применялась стандартизация по массе действующего вещества, но в следствие вышеперечисленных препятствий она не смогла решить эту задачу. Биологическая стандартизация, которая проводится на сенсибилизированном организме пациентов-добровольцев, должна была привести все аллергены к единому эталону – ответу пациента «in vivo» на введение аллергена. Однако возник ряд трудностей:
• Аллергенность препарата и его способность вызывать кожную реакцию при введении не означает стабильного иммунного ответа с образованием клеток памяти, обеспечивающих долговременную эффективность.
• Компании – производители не смогли прийти к соглашению об использовании единой методики биологического тестирования. В Европе используются различные модификации прик – тестов с гистамином, кодеином, вообще без положительного контроля, в США – внутрикожные тесты, что не позволяет уверенно говорить о полной эквивалентности доз.
• Нет «референсных» значений нормального иммунного ответа после иммунотерапии и понимания какая доза аллергена должна быть в препарате. Разные способы введения аллергена требуют доз, отличающихся в десятки раз. При сублингвальной терапии суммарные дозы за год в разы превышают количества аллергена при подкожном введении. При проведении оральной иммунотерапии аллерген часто считается в граммах, биологичекая стандартизация сырья не применяется вообще.
Сама постановка задачи стандартизации лечебного аллергена является нетривиальной: требуется привести препарат к некоему единому значению (условно – безопасной, но эффективной дозе) для больных людей разного пола, возраста, расы, разной силы сенсибилизации, с девиантным иммунным ответом. Подчеркнем, что в условно – здоровом организме IgE – зависимый иммунный ответ в подавляющем случае на вышеперечисленные аллергены не возникает и вопрос о степени его «силы в норме» некорректен. Скорее мы говорим о некотором усредненном значении активности аллергена в препарате, которое можно очень условно перенести на генеральную популяцию.
В данном разделе будут рассмотрены основные особенности стандартизации применяемых в России лечебных аллергенов с точки зрения реальной клинической практики. В юридическом аспекте, производство и использование аллергенов в РФ регулируется государственной фармакопеей, разделом «ОФС.1.7.1.0001.15 Аллергены»1, где изложены основные принципы производства и стандартизации аллергенов. Принимая во внимание различные технологии у компаний производителей, фармакопея дает самые общие рекомендации, которые могут быть выполнены всеми участниками. Аналогичные документы существуют в Европе и США, и точно также они не позволяют жестко привести все лечебные аллергены к одному эталону. Появление новых препаратов, изменение лекарственных форм вносит коррективы в методы стандартизации аллергенов. Многие методы являются частью внутренних стандартов компаний производителей и являются коммерческой тайной. Информация, представленная в главе получена из общедоступных источников и может отличаться от действительной из-за постоянной модернизации производства аллергенов. Изложение принципов стандартизации не несет цели сравнения препаратов и выбора лучшего решения, а служит для ознакомления читателя с методикой производства и более глубокого понимания иммунотерапии лечебными аллергенами.
4.1. Проблематика. Подготовка сырья
Вопросы стандартизации аллергенов на сегодняшний день остаются решенными не в полном объёме. Многокомпонентность препарата, полученного из натурального сырья, делает сложным сравнение лекарственных средств, произведенных не только по разным технологиям, но и даже между партиями внутри одной компании.
Этапы производства аллергенов регламентируются статьями Государственной фармакопеи РФ. Существует ряд стандартов и требований, предъявляемых к производству, которые необходимо рассматривать с точки зрения гармонизации производства с акцентом на повышение однообразия антигенного состава натурального сырья.
Для производства пыльцевых аллергенов используется пыльца, собранная на специальных делянках в период активного пыления. Рекомендуется использование смеси пыльцы, полученной за 2—3 сезона, чтобы усреднить показатели биологического сырья, зависящие от климатических условий. В РФ допускается не более 10% пыльцы других видов растений в исходном сырье, в ЕС не более 5%. На первом этапе после сбора сырья, его измельчения, экстракции аллергена происходит первичный контроль качества биологического продукта визуально с помощью микроскопии. В препарате аллергена допускается наличие не более 0,5—1% посторонних примесей.
Пыльца является относительно простым продуктом, легко собирается, измельчается и при правильном культивировании достаточно однородна, что позволяет получать аллергенное сырье, содержащее естественную экспозицию белковых молекул.
Похожим образом получают аллергены плесени из предварительно высушенных и измельченных культивируемых грибов определенного вида. Содержание микотоксинов и вредных примесей минимизируется. Аллергены из клещей домашней пыли производят из искусственно выращенных насекомых, содержащихся в стерильных условиях 3—4 месяца и получающих определенный вид пищи с целью более однородного антигенного состава. На производстве поддерживается видовой контроль популяции, поэтому содержание основных антигенов клещей там более стабильно по сравнению с видами, живущими в естественных условиях.
Эти 3 группы аллергенных препаратов отличает возможность их искусственного выращивания, полного измельчения и, соответственно, в конечном продукте содержание белка будет более близко соответствовать натуральному сырью, с поправкой на термолабильность белков и возможное изменении их структуры при использовании консервантов. Однако, даже в этих случаях при сравнении препаратов различных производителей наблюдаются значительные колебания в составе белков.
Основные вопросы к производству и составу возникают при использовании аллергенов животных, библиотечной и домашней пыли вследствие очевидной сложности приготовления и сбора сырья. Невозможно стабильно воссоздавать комплексные аллергены из-за влияния различных факторов (сезона, географии и т.п.) или вследствие содержания в организме животного большого количества белка не являющегося причинно – значимым аллергеном.
Пыль, используемая при производстве бытовых аллергенов, собирается с поверхности мебели в домах пациентов, страдающих аллергией. Однако, стоит понимать, что пыль представляет собой сложный конгломерат минеральных и биологических частиц, который существенно различается в различных странах и домах. Подавляющей фракцией аллергена в домашней пыли являются пироглифные клещи, но в основе субстрата пыли – механические частицы тканей, минеральных веществ. Домашняя пыль кроме акарокомплекса всегда содержит примеси, которые зависят от климатической зоны и состава иных аллергенов помещений. Так по разным данным в пыли могут определяться значимые количества эпителия животных, пыльцы растений, белков пищи. Анализируя состав пыли из детских спален (США, Канзас), рабочая группа Barnes C. определила, что в образцах практически постоянно встречаются ряд антигенов (кроме клещей Der f 1 & Der p 1): таракан (Bla g 2), утероглобин кошки (Fel d 1), липокалин шерсти собаки (Can f 1), антигены мыши (Mus m 1) а также плесневых грибов (
Более того, при долговременных исследованиях, проведенных в нашей стране, была замечена нестабильность состава акарокомплекса домашней пыли, проявившаяся в уменьшении доли